legarea IgG1 și IgG3 și activarea FcyR

deoarece IgG1 predomină în serul uman și a fost ușor disponibilă ca proteină monoclonală izolată din serul pacienților cu cancer de celule plasmatice (mielom multiplu), studiile structurale și funcționale timpurii s-au concentrat asupra acestei subclase de IgG. S-a dovedit că IgG1 a definit toate funcțiile de legare a ligandului mediate de IgG-Fc și de activare efectoare. Studiile Comparative au demonstrat că IgG3 mediază o activitate funcțională comparabilă, în timp ce IgG2 și IgG4 prezintă restricții într-una sau mai multe activități. Genele regiunii constante IgG sunt polimorfe, iar acest lucru se reflectă în moștenirea haplotipurilor genei IgG și în consecință diferențe în secvențele de proteine IgG-Fc.29 puține studii au abordat impactul polimorfismelor IgG-Fc asupra structurii și funcției; cu toate acestea, IgG3 prezintă un polimorfism foarte extins cu forme alotipice care diferă prin capacitatea lor de a lega SpA.32 în schimb, unele studii s-au concentrat asupra posibilelor influențe ale polimorfismelor IgG asupra răspunsurilor clinice la agenții infecțioși.33,34

în urma scanării inițiale a mutantului IgG1-Fc pentru legarea și activarea FcyRI,17,18 Shields și colab.35 a publicat un studiu cuprinzător care a folosit variante himerice IgG1, IgG2, IgG3 și IgG4 ale unui anticorp anti-IgE. Toate reziduurile izotipului IgG1 expuse la solvent au fost substituite secvențial cu alanină. Proteinele IgG și domeniile extracelulare ale lui FcyR și FcRn au fost exprimate în celule HEK293, acum s-a demonstrat că generează glicoforme atipice FcyRIIIa. Produsele proteice IgG au fost clasificate în funcție de legarea lor la subtipurile FcyR și FcRn într-un test ELISA: clasa 1 a prezentat o legare redusă la toate FcyRs; clasa 2, legare redusă la FcyRII și FcyRIIIa; clasa 3, legare îmbunătățită la FcyRII și FcyRIIIa; etc. În mod semnificativ, reziduurile din regiunea balamalei inferioare, cuprinzând secvența –L234–L–G–G237, s– au dovedit a influența legarea la toate subtipurile FcyR testate, dar nu FcRn. Aceste date au fost contraintuitive la acea vreme, deoarece secvența –L234–L–G–G237 nu a dat Conformație definită în structura Deisenhofer IgG-Fc18 și s-a presupus că este mobilă; această enigmă a fost rezolvată prin publicarea unei structuri cristaline cu raze X pentru IgG1-Fc în complex cu o formă aglicozilată de FcyRIIIb care a arătat legarea în regiunea balamalei inferioare și cuprinzând secvența –L234–L–G–G237 care a presupus o structură definită în cadrul complexului.37,38 flexibilitatea în regiunea balamalei moleculei IgG intacte permite fiecărei regiuni Fab să-și angajeze antigenul specific cu generarea unui echilibru de conformeri IgG-Fc care pot găzdui, separat, legarea la un FcyR individual. Subtilitatea conformației IgG-Fc și recunoașterea FcyR este subliniată de constatarea că substituirea anumitor reziduuri în domeniul CH3 a influențat, de asemenea, afinitatea de legare a FcyR. Într-o publicație ulterioară, Shields și colab.38 a demonstrat o creștere de 50 de ori a afinității de legare a unei glicoforme non-fucosilate a IgG-Fc pentru FcyRIIIa și o creștere consecutivă a ADCC mediată de celulele NK. În deceniul care a urmat acestor publicații de referință, cercetările au fost îndreptate spre maximizarea sau minimizarea diferențiată a legării și activării FcyR și FcRn selectate, cu scopul de a genera terapii cu anticorpi cu un profil de funcție efectoare care ar putea fi optim pentru o anumită indicație a bolii in vivo. Un obiectiv special a fost acela de a regla în mod diferențiat în sus sau în jos interacțiunea cu FcyR activator și inhibitor.

evaluarea inițială a mecanismului de acțiune al rituximab a indicat ADCC, mediată prin implicarea FcyRIIIa exprimată pe celulele NK. Această concluzie a fost susținută de constatarea că remisia bolii în limfomul non-Hodgkin a fost legată de variante polimorfe ale receptorului FcyRIIIa care diferă în afinitatea lor pentru IgG1-Fc.39,40 produsele alelice diferă în prezența valinei (V) sau fenilalaninei (F) la poziția 158 (FcyRIIIa-V158 și FcyRIIIa-F158) în domeniul extracelular. Ulterior, aceste reziduuri s-au dovedit a fi localizate în cadrul sitului de interacțiune IgG-Fc/FcyRIII.36,37 în consecință, cercetările au fost îndreptate spre generarea de anticorpi cu mutații IgG-Fc care au ca rezultat o afinitate crescută de legare pentru produsele fiecărei alele FcyRIIIa, cu așteptarea unei creșteri consecvente a ADCC, indiferent de haplotipul FcyRIIIa al unui pacient. Demonstrația anterioară a afinității crescute pentru IgG1-Fc afucosilat a fost consolidată odată cu dezvoltarea liniilor celulare de producție stabile care generează anticorpi non-fucosilați.38,41,42 eficacitatea îmbunătățită pentru uciderea celulelor canceroase demonstrată in vitro pentru acești anticorpi a încurajat alte grupuri de cercetare și companii să încerce să îmbunătățească ADCC mediată de FcyRIIIa prin ingineria proteinelor. În plus față de provocarea intelectuală, succesul ar putea genera o proprietate intelectuală semnificativă (PI) și oportunități de achiziție a brevetelor care ar putea fi exploatate pentru generarea de biobetter therapeutics.

folosind algoritmi de proiectare computațională și screening de mare viteză, Xencor a generat un panou extins de mutanți IgG-Fc care prezintă profiluri modificate ale activităților de legare FcyR și biologice.43-46 o mutație „de bază” pare să fie schimbul de reziduuri S239D/I332E pentru a produce un IgG-Fc care a prezentat o afinitate crescută de ~40 de ori pentru ambele forme polimorfe de FcyRIIIa și o creștere de ~10 ori pentru FcyRIIa și FcyRIIb.44 un anticorp anti-CD40 care poartă mutația s239d / I332E a prezentat o creștere de ~150 ori a ADCC pentru celulele leucemice, comparativ cu proteina IgG1 de tip sălbatic; în schimb, legarea FcyR a fost abrogată pentru mutantul dublu G236R/L328R.44 S-a demonstrat în continuare că generarea unei forme aglicozilate de IgG-Fc având secvența N297D/a330y/I332E a restabilit ~43% afinitate de legare pentru FcyRIIIa.45,46 a rămas o provocare de a genera afinitate crescută pentru receptorul fcyriia activator, dar afinitate mai mică pentru receptorul fcyriib inhibitor. Mutantul s239d/I332E / G236 a prezentat această proprietate;46 mutația G236A singură a furnizat afinitate FcyRIIa de 70 de ori mai mare și a mediat adcp îmbunătățit de macrofage.47 interesant, acest mutant s-a dovedit a avea un efect minim asupra legării FcyRI, spre deosebire de rapoartele anterioare de legare și activare FcyRI diminuate sau pierdute.48,49 Sazinsky și colab.50 a concentrat atenția asupra reziduurilor 296 până la 300 și a arătat că un IgG mutant n297/s298g/T299A a fost aglicozilat atunci când a fost produs în celule HEK293, dar a prezentat afinități pentru FcyRIIa și FcyRIIb comparabile cu IgG-Fc de tip sălbatic. Mutanții cu afinitate crescută pentru FcyRIIIa au fost generați de Macrogenici care utilizează un ecran genetic funcțional prin tehnologia de afișare a drojdiei. O serie de proteine IgG au fost izolate cu substituții atât în domeniile CH2, cât și în CH3, care au prezentat profiluri individuale de recunoaștere FcyR. Un anticorp anti-HER2 a fost dezvoltat purtând un Fc cu cinci substituții (L235V, F243L, R292P, Y300L P396L) care au prezentat o legare îmbunătățită la FcyRIIIa, dar au redus legarea la receptorul inhibitor FcyRIIb. Această construcție a prezentat o ucidere îmbunătățită a celulelor canceroase care exprimă HER2, arătând o rată de liză crescută de ~100 de ori comparativ cu proteina de tip sălbatic.51,52

un grup cuprinzător de IgG-Fc aglicozilat a fost generat prin substituirea asparaginei 297 cu fiecare dintre aminoacizii alternativi. Mutantul n297y a fost selectat pentru mutageneza de saturație a sitului genic (gssm), cu generarea a 222 de mutanți suplimentari care au fost examinați pentru legarea la FcyR, FcRn și C1q și pentru capacitatea lor de a promova fagocitoza.53 după cum era de așteptat, majoritatea mutanților au prezentat o activitate de legare mai mică sau deloc; cu toate acestea, mutanții cu creșteri de 32, 15 și 11 ori în legarea la FcyRIIIa au fost raportate pentru variantele N297Y/Ser254W, n297yq418w și, respectiv, n297y/V259Y. Mulți mutanți au avut activitate de legare pentru FcyRI similară sau crescută în raport cu tipul sălbatic și/sau legare crescută la FcRn; în schimb, legarea la Fcyria a fost practic abolită pentru fiecare dintre mutanți. În mod surprinzător, mutantul N297A a fost raportat că are o activitate aproape de tip sălbatic, spre deosebire de rapoartele anterioare de pierdere a legării pentru FcyRI.54

Jung și colab.55 a profitat de incapacitatea Escherichia coli de a efectua glicozilarea folosind expresia pentru a examina o bibliotecă combinatorie de mutanți IgG-Fc care se leagă de FcyR. Ei au caracterizat mutantul dublu, e382v / M428I, în regiunea CH3, care a conferit legarea la FcyRI cu o afinitate aproape identică cu cea a anticorpilor IgG1 glicozilați.55,56 legarea la toate celelalte Fcyr-uri a fost ablată; interesant, legarea la toate Fcyr-urile a fost observată pentru forma glicozilată a acestui mutant de anticorpi atunci când a fost produsă în celulele HEK293. Când a fost introdus în anticorpul anti-HER2 trastuzumab și produs în E. coli, produsul a efectuat ADCC mediat de celule dendritice, spre deosebire de trastuzumab glicozilat de tip sălbatic.55,56 este remarcabil faptul că aceste substituții din domeniul CH3 ar trebui să aibă o influență atât de profundă asupra legării FcyR la locul balamalei inferioare; cu toate acestea, reziduurile E382V/M428I sunt reziduuri de contact la interfața CH2–CH3 și, probabil, perturbarea acestei interacțiuni poate influența conformația la distanță.

afișarea ribozomilor predispuși la erori a fost utilizată pentru a genera panouri de mutanți IgG-Fc care au fost examinați pentru legarea îmbunătățită la FcyRIIIa.57 mutantul F243L/T393A / H433P a avut o afinitate crescută de legare pentru FcyRIIIa și s-a demonstrat că mediază ~ADCC îmbunătățit de patru ori. Au fost prezentate dovezi care sugerează că mutația F243L a fost cea mai mare parte responsabilă pentru activitatea îmbunătățită; cu toate acestea, funcția îmbunătățită se poate corela mai îndeaproape cu creșterea observată a nivelurilor de glicoforme lipsite de fucoză, dar care exprimă N-acetilglucozamină bisectantă. Studiile anterioare au raportat că un mutant F243A, produs în celulele CHO, a fost fucosilat și a prezentat niveluri ridicate de galactozilare și sialilare, cu o reducere semnificativă a legării FcyRI.58

Posted on

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.