IgG1 e IgG3 Ligação e Ativação de FcyR

Porque IgG1 predomina no soro humano, e foi prontamente disponível como um anticorpo monoclonal proteína isolada do soro de pacientes com cânceres de células plasmáticas (mieloma múltiplo), no início estrutural e funcional, os estudos foram focados nesta subclasse de IgG. Verificou-se que IgG1 definiu todas as funções de ligação e ativação efetoras do ligante mediado por IgG-Fc. Estudos comparativos demonstraram que IgG3 medeia atividade funcional comparável, enquanto IgG2 e IgG4 exibem restrições em uma ou mais atividades. Os genes da região constante de IgG são polimórficos, e isso se reflete na herança de haplótipos do gene IgG e consequentes diferenças nas sequências de proteínas IgG-Fc.29 poucos estudos abordaram o impacto dos polimorfismos IgG-Fc na estrutura e função; no entanto, o IgG3 exibe um polimorfismo muito extenso com formas alotípicas que diferem em sua capacidade de ligar SpA.32 por outro lado, alguns estudos se concentraram em possíveis influências de polimorfismos IgG nas respostas clínicas a agentes infecciosos.33,34

após a varredura inicial do mutante IgG1-Fc para ligação e ativação de FcyRI, 17, 18 Shields et al.35 publicou um estudo abrangente que empregava variantes quiméricas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de um anticorpo anti-IgE. Todos os resíduos expostos a solventes do isótipo IgG1 foram substituídos sequencialmente por alanina. As proteínas IgG e os domínios extracelulares marcados com His de FcyR e FcRn foram expressos em células HEK293, agora mostrando gerar glicoformas atípicas de FcyRIIIa. A IgG produtos de proteína foram classificadas de acordo com sua vinculação para os subtipos de FcyR e FcRn em um ensaio ELISA: Classe 1 exibiu reduzido obrigatório para todos os FcyRs; Classe 2, reduzida ligação para FcyRII e FcyRIIIa; Classe 3, a melhoria de ligação para FcyRII e FcyRIIIa; etc. Significativamente, resíduos na região de dobradiça inferior, abrangendo a sequência –L234–L–G– G237, mostraram influenciar a ligação a todos os subtipos FcyR testados, mas não FcRn. Esses dados foram contraintuitivos na época, pois a sequência –L234-L-G-G237 não produziu conformação definida na estrutura Deisenhofer IgG-Fc18 e foi considerada móvel; este enigma foi resolvido com a publicação de uma estrutura de cristal de raios-X para IgG1-Fc em complexo com uma forma aglicosilada de FcyRIIIb que mostrou ligação para estar na região da dobradiça inferior e abraçando a sequência –L234–L–G–G237 que assumiu estrutura definida dentro do complexo.37,38 a flexibilidade dentro da região de dobradiça da molécula IGG intacta permite que cada região Fab engate seu antígeno específico com a geração de um equilíbrio de conformadores IgG-Fc que podem, separadamente, acomodar a ligação a um FcyR individual. A sutileza da conformação IgG-Fc e do reconhecimento FcyR é sublinhada pela constatação de que a substituição de certos resíduos dentro do domínio CH3 também influenciou a afinidade de ligação FcyR. Em uma publicação subsequente, Shields et al.38 demonstraram um aumento de 50 vezes na afinidade de ligação de um glicofórmio não fucosilado de IgG-Fc para FcyRIIIa e um consequente aumento no ADCC mediado por células NK. Na década seguinte a essas publicações marcantes, a pesquisa tem sido direcionada para maximizar ou minimizar diferencialmente a ligação e ativação de fcyr e FcRn selecionados, com o objetivo de gerar terapêutica de anticorpos com um perfil de função efetora que pode ser ideal para uma determinada indicação de doença in vivo. Um objetivo específico tem sido a interação diferencialmente para cima ou para baixo-regulação com fcyr ativador e inibitório.

a avaliação inicial do mecanismo de ação do rituximabe indicou ADCC, mediada pelo engajamento da FcyRIIIa expressa em células NK. Esta conclusão foi apoiada pela descoberta de que a remissão da doença no linfoma não-Hodgkin estava ligada a variantes polimórficas do receptor FcyRIIIa que diferem em sua afinidade pelo IgG1-Fc.39,40 Os alelos produtos diferem na presença de valina (V) ou fenilalanina (F) na posição 158 (FcyRIIIa-V158 e FcyRIIIa-F158) no domínio extracelular. Posteriormente, esses resíduos mostraram-se localizados dentro do local de interação IgG-Fc/FcyRIII.36,37 consequentemente, a pesquisa tem sido direcionada para a geração de anticorpos com mutações IgG-Fc que resultam em maior afinidade de ligação para produtos de cada Alelo FcyRIIIa, com a expectativa de um consequente aumento do ADCC independentemente do haplótipo FcyRIIIa de um paciente. A demonstração anterior de maior afinidade pelo Afucosilado IgG1-Fc foi consolidada com o desenvolvimento de linhas celulares de produção estáveis gerando anticorpos não fucosilados.38,41,42 a eficácia melhorada para matar células cancerígenas demonstrada in vitro para esses anticorpos encorajou outros grupos de pesquisa e empresas a tentar melhorar o ADCC mediado por FcyRIIIa por meio da engenharia de proteínas. Além do desafio intelectual, o sucesso poderia gerar significativa propriedade intelectual (PI) e oportunidades de aquisição de patentes que poderiam ser exploradas para a geração de terapias biobetter.

usando algoritmos de design computacional e triagem de alto rendimento, a Xencor gerou um extenso painel de mutantes IgG-Fc exibindo perfis alterados de atividades biológicas e de ligação FcyR.43-46 Um “core” de mutação parecia ser a troca de resíduos S239D/I332E para produzir um IgG-Fc, que exibiu ~40 vezes maior afinidade para ambas as formas polimórficas de FcyRIIIa e um ~aumento de 10 vezes para FcyRIIa e FcyRIIb.44 um anticorpo anti-CD40 com a mutação S239D / I332E exibiu um aumento de ~150 vezes no ADCC para células leucêmicas, em comparação com a proteína IgG1 do tipo selvagem; em contraste, a ligação FcyR foi revogada para o mutante duplo G236R/L328R.44 foi demonstrado ainda que a geração de uma forma aglicosilada de IgG-Fc tendo a sequência n297d/A330y/I332E restaurada ~43% afinidade de ligação para FcyRIIIa.45,46 um desafio permaneceu para gerar maior afinidade para o receptor fcyria ativador, mas menor afinidade para o receptor fcyriib inibitório. O mutante s239d/I332E / G236 exibiu essa propriedade; 46 a mutação g236a sozinha entregou afinidade FcyRIIa ~70 vezes maior e mediou ADCP aprimorado por macrófagos.47 curiosamente, este mutante demonstrou ter um efeito mínimo na ligação FcyRI, em contraste com relatos anteriores de ligação e ativação fcyri diminuída ou perdida.48,49 Sazinsky et al.50 focou a atenção nos resíduos 296 a 300 e mostrou que um IGG mutante n297/S298G/T299A foi aglicosilado quando produzido em células HEK293, mas exibiu afinidades para Fcyria e FcyRIIb comparáveis ao IGG-Fc do tipo selvagem. Mutantes com maior afinidade por FcyRIIIa foram gerados por Macrogênicos empregando uma tela genética funcional por meio da tecnologia de exibição de levedura. Uma série de proteínas IgG foram isoladas com substituições nos domínios CH2 e CH3 que exibiram perfis individuais de reconhecimento FcyR. Um anticorpo anti-HER2 foi desenvolvido com um FC com cinco substituições (L235V, F243L, R292P, Y300L P396L) que exibiu ligação aprimorada à FcyRIIIa, mas reduziu a ligação ao receptor inibitório de FcyRIIb. Este construto exibiu morte aprimorada de células cancerígenas que expressam HER2, mostrando uma taxa de lise aumentada em ~100 vezes em comparação com a proteína do tipo selvagem.51,52

um painel abrangente de IgG-Fc aglicosilado foi gerado PELA substituição da asparagina 297 por cada um dos aminoácidos alternativos. O mutante N297Y foi selecionado para mutagênese de saturação do local do Gene™ (GSSM™), com a geração de 222 mutantes adicionais que foram selecionados para ligação a FcyR, FcRn e C1q e por sua capacidade de promover fagocitose.53 como esperado, a maioria dos mutantes exibiu atividade de ligação menor ou nenhuma; no entanto, mutantes com aumentos de 32, 15 e 11 vezes na ligação ao FcyRIIIa foram relatados para as variantes N297Y/Ser254W, n297yq418w e n297y/V259Y, respectivamente. Muitos mutantes tinham atividade de ligação para FcyRI semelhante ou aumentada em relação ao tipo selvagem e/ou aumento da ligação ao FcRn; em contraste, a ligação à Fcyria foi praticamente abolida para cada um dos mutantes. Surpreendentemente, o mutante n297a foi relatado como tendo atividade quase selvagem, em contraste com relatos anteriores de perda de ligação para FcyRI.54

Jung et al.55 aproveitou-se da incapacidade de Escherichia coli para efetuar a glicosilação usando expressão para selecionar uma biblioteca combinatória de mutantes IgG-Fc que se ligam ao FcyR. Eles caracterizaram o mutante duplo, E382V/M428I, dentro da região CH3, que conferiu ligação ao FcyRI com uma afinidade quase idêntica à dos anticorpos IgG1 glicosilados.55,56 a ligação a todos os outros FcyRs foi diminuída; curiosamente, a ligação a todos os FcyRs foi observada para a forma glicosilada deste anticorpo mutante quando produzido em células HEK293. Quando introduzido no anticorpo anti-HER2 trastuzumab e produzido em E. coli, o produto efetuou ADCC mediado por células dendríticas, em contraste com o trastuzumab glicosilado de tipo selvagem.55,56 é notável que essas substituições dentro do CH3 domínio deve ter uma influência tão profunda sobre FcyR ligação na parte inferior da dobradiça do site; no entanto, o E382V/M428I resíduos são contacto resíduos no CH2–CH3 interface, e, presumivelmente, perturbação dessa interação pode influenciar a conformação à distância.

a exibição de ribossomo propensa a erros foi empregada para gerar painéis de mutantes IgG-Fc que foram selecionados para ligação aprimorada ao FcyRIIIa.57 o mutante F243L / T393A / H433P aumentou a afinidade de ligação para FcyRIIIa e foi mostrado para mediar ~ ADCC quatro vezes maior. Evidências foram apresentadas para sugerir que a mutação F243L foi a principal responsável pelo aumento da atividade; no entanto, a função melhorada pode se correlacionar mais de perto com o aumento observado nos níveis de glicoformas sem fucose, mas expressando bissetriz N-acetilglucosamina. Estudos anteriores relataram que um mutante F243A, produzido em células CHO, foi fucosilado e exibiu altos níveis de galactosilado e sialilação com redução significativa na ligação ao FcyRI.58

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