iGluSnFr fluoresces with glutamate input and measure neuronal communicationw poprzednim poście na blogu omówiliśmy, w jaki sposób fluorescencyjne białka mogą być używane do konstruowania biosensorów, narzędzi biologicznych, które monitorują procesy lub wykrywają cząsteczki. Tutaj będziemy zanurkować w szczegółach dotyczących SF-iGluSnFr, niedawno ulepszonego biosensora zaprojektowanego do wykrywania glutaminianu.

początki iGluSnFr

fluoresces iGluSnFr z wiązaniem glutaminianuiGluSnFr został opracowany w 2013 roku przez Laboratorium Loren Looger, aby dać naukowcom możliwość monitorowania uwalniania glutaminianu z neuronów i innych komórek mózgu in vivo. Glutaminian odgrywa różne role w komunikacji synaptycznej i może powodować inne formy sygnalizacji neuronalnej i regulacji.

aby stworzyć iGluSnFr, Looger lab zaklinował GFP pomiędzy dwie połówki bakteryjnie pochodzącego periplazmicznego białka wiążącego glutaminian znanego jako GltI. Gdy powstałe białko fuzyjne wiąże się z glutaminianem, zmiany konformacyjne prowadzą do zwiększenia intensywności fluorescencji z wstawionego GFP.

po scharakteryzowaniu iGluSnFr in vitro, wykazując, że jest selektywnie aktywowany przez glutaminian i poprawiając go w celu poprawy jego reakcji, looger lab wykazał, że iGluSnFr może wykrywać aktywność neuronalną U C. elegans, danio pręgowanego i myszy.

pobierz ebook Fluorescent Proteins 101

uaktualnienia do iGluSnFr

chociaż ta pierwsza wersja iGluSnFr nie była optymalna do eksperymentów wymagających wysokiego stosunku sygnału do szumu lub obrazowania zdarzeń sygnalizacji glutaminianu o wysokiej częstotliwości. Dlatego looger lab poprawił iGluSnFr na 3 główne sposoby opisane tutaj. Naukowcy wykonali następujące czynności:

  1. zwiększona jasność iGluSnFr
  2. stworzono nowe warianty iGluSnFr o różnej kinetyce wiązania glutaminianu
  3. stworzono niebieskie i żółte warianty iGluSnFr

Znajdź plazmidy SF-iGluSnFr tutaj!

zwiększona jasność

w swojej pierwszej zmianie na iGluSnFr, Marvin i inni zamienili eGFP na sfGFP, aby utworzyć SF-iGluSnFr. Ten ulepszony wariant ma wyższy poziom ekspresji u bakterii i ostatecznie wytwarza silniejsze sygnały fluorescencyjne po wykryciu glutaminianu w modelach myszy i fretki.

zwiększona wszechstronność dzięki zróżnicowanej kinetyce wiązania glutaminianu

 miareczkowanie glutaminianu dla wariantów iGluSnFr chociaż pierwotny iGluSnFr miał fizjologicznie istotne powinowactwo 4 µM do glutaminianu w hodowli komórkowej, ten stosunkowo niski poziom powinowactwa wpływał na wydajność w następujących warunkach:

  1. eksperymentalne konfiguracje, które wymagają wykrywania sygnału o niskiej częstotliwości, zwiększonego powinowactwa i wysokiego stosunku sygnału do szumu
  2. Identyfikacja dyskretnych zdarzeń o wysokiej częstotliwości – wymagają one niższego powinowactwa (poprzez szybsze szybkości wyłączania) w celu identyfikacji sygnałów z poszczególnych zdarzeń

aby przezwyciężyć te problemy, Marvin i wsp.zmutowali region białka fuzyjnego iGluSnFr, o którym wiadomo, że jest ważny dla powinowactwa. Mutacja tego tak zwanego „regionu zawiasowego” zaowocowała zidentyfikowaniem dwóch użytecznych wariantów:

  • SF-iGluSnFr.A184S (zwiększone powinowactwo do glutaminianu)
  • SF-iGluSnFr.S72A (zmniejszone powinowactwo do glutaminianu)

Marvin et al. ponadto pokazują, że wariant a184s wytwarza bardziej intensywny sygnał fluorescencyjny w odpowiedzi na niższe stężenia glutaminianu w porównaniu do iGluSnFr. Z drugiej strony wariant S72A jest lepszy w wykrywaniu powtarzających się zdarzeń o wysokiej częstotliwości, takich jak neuronalne uwalnianie glutaminianu po stymulacji elektrycznej. Dzięki tym wariantom naukowcy mogą wybrać konkretne narzędzie, które najlepiej odpowiada ich potrzebom eksperymentalnym.

nowe kolory SF-iGluSnFr

oryginalny iGluSnFr pojawił się tylko w jednym kolorze – zielonym. Badacz może potrzebować więcej kolorów, aby zobrazować oddzielne zdarzenia sygnalizacyjne w pobliskich komórkach lub łatwo zidentyfikować sygnalizację glutaminianu w określonych typach komórek. Marvin i wsp. zamienili nasz chromofor GFP w iGluSnFr i zoptymalizowali glti-fluorescencyjne wiązania białkowe w razie potrzeby do produkcji niebieskich (SF-Azurite-iGluSnFr) i żółtych (SF-Venus-iGluSnFr) wariantów. Rzeczywiście, oprócz dodawania nowych kolorów, Żółty wariant może być również obrazowany przez tanie 1030 nm dwa fotonowe lasery femtosekundowe, które mogą wzbudzić wiele obszarów w jednej próbce. Dzięki tym konstrukcjom SF-iGluSnFr naukowcy mają zarówno nowe kolory iGluSnFr, jak i nowe sposoby ich ekscytowania!

używanie SF-iGluSnFr w laboratorium

nowe warianty SF-iGluSnFr powinny umożliwić naukowcom wykrywanie zdarzeń sygnalizacyjnych w mózgu i poza nim. Looger lab koncentruje się na zastosowaniach SF-iGluSnFr w neurobiologii w omawianych tutaj artykułach, ale, jak wspominają w swojej pracy z 2013 roku, sygnalizacja glutaminianu występuje w wielu kontekstach i może być przydatna dla naukowców pracujących w organizmach, od bakterii po zwierzęta i rośliny.

warianty SF-iGluSnFr są dostępne w wektorach AAV dostępnych z Addgene. Laboratorium Looger przedstawiło Krótki opis systemów promotorów, których można użyć do wyrażenia wariantów SF-iGluSnFr:

    • CAG: generyczny silny promotor. Sformułowany jako AAV-DJ dla ekspresji neuronalnej.
    • CAG-FLEX: promotor CAG, Wygięty W celu ekspresji w komórkach Cre-ekspresyjnych.
    • hsynap: promotor ludzkiej Synapsyny-1. Dobre dla ekspresji neuronalnej.
    • hsynap-FLEX: promotory Synanpsyn-1, zginane w celu ekspresji w komórkach ekspresji Cre.
    • GFAP: glejowe włókniste kwaśne białko (promotor). Dobre dla ekspresji Gliall (nie neuronów).

jesteśmy podekscytowani, aby zobaczyć, jak korzystać z tych wspaniałych nowych narzędzi!

Pobierz ebooka Viral Wektory 101

1. Marvin, Jonathan S., et al. „Stabilność, powinowactwo i chromatyczne warianty czujnika glutaminianu iGluSnFR.”Nature Methods (2018): 936-939. PubMed PMID: 30377363.

Znajdź plazmidy SF-iGluSnFr tutaj!

2. Marvin, Jonathan S., et al. „Zoptymalizowana sonda fluorescencyjna do wizualizacji neurotransmisji glutaminianu.”Nature methods10.2 (2013): 162. PubMed PMID: 23314171. PubMed Central PMCID: PMC4469972.

dodatkowe zasoby na blogu Addgene

  • dowiedz się więcej o innych Bioczujnikach fluorescencyjnych
  • praktyczne podejście do wyboru białka fluorescencyjnego B (po prawej)est
  • odwiedź Stronę promowaną białkiem fluorescencyjnym

Posted on

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.