linie komórkowe i odczynniki

zarówno komórki HeLa, jak i a549 zostały zamówione z ATCC i hodowane w zmodyfikowanym ośrodku Eagle ’ a Dulbecco (Dmem, Gibco 12800-017) zawierającym 10% FBS (Hyclone SN30087.02). Przeciwciała IFITM1, IFITM2 i IFITM3 zostały zamówione z technologii sygnalizacji komórkowej (13126 S), grupy Proteintech (66137-1-Ig) i Abgent (AP1153a). Anty-IFITM3 (poliklonal) 10088-604 pochodzi z VWR International. Przeciwciało EGFR pochodziło z Abcam (ab32077). Przeciwciało TfR pochodzi z układów R&d (AF2474). Alexa-Fluor 488-CD63 (sc-5275)pochodził z Santa Cruz. Przeciwciało nukleoproteinowe wirusa grypy A (ab20343) pochodziło z Abcam. Alexa-Fluor 647 Antibody Labeling Kit (A20186) został zamówiony W Life Technologies. Wtórne przeciwciała sprzężone z HRP goat anty-mysi IgG (HCL) (115-035-003) i sprzężone z HRP goat anty-króliczy IgG (HCL) (111-035-003) zostały zakupione od Jackson ImmunoResearch. Przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (#HAF016)zostało zamówione w Fisher Scientific. Przeciwciało anty-HA sprzężone z Alexa-Fluor 594 zakupiono od Life Technologies. Anty-HA przeciwciało sprzężone z HRP zamówiono w firmie Roche. Anty-calnexin (ab22595) pochodzi z Abcam. Dekstran-Alexa-Fluor 488 (D22910), dekstran-pHrodo-red (P10361), transferrin-Alexa-Fluor 647 (T23366) i rekombinowany ludzki EGF (10605hnae25) pochodziły z Life Technologies. Holo-Transferryna ludzka (t0665) pochodziła z Sigmy-Aldrich. Ludzki interferon α (IFN-α, 8927sc) pochodził z technologii sygnalizacji komórkowej. Grypa a/PR/8 / 34 (H1N1) (10100374) pochodzi z Charles River Laboratories. Magic Red Cathepsin B Assay Kit (937) pochodzi z technologii immunochemicznych. Bafilomycyna A1 (ab120497) pochodzi z Abcam. 6-TAMRA, specjalny preparat (6-karboksytetrametylorhodamina, AS-81122) pochodził z ANASPEC. Quikchange II site-Directed Mutagenesis Kit (#200523) pochodzi z firmy Agilent Technologies. Endonukleaza T7 i (M0302S) pochodziła z New England BioLabs.

plazmidy

pEF-ifitm1, ifitm2, IFITM3 sklonowano przez amplifikację PCR i wstawiono do wektora pEF6-BSD. Wszystkie mutanty IFITM3 zostały wygenerowane przy użyciu zestawu Quikchange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Plazmid pCAS9 i Wektor podstawowy gRNA (pGL3-U6) zostały podarowane przez W. Wei (Uniwersytet Pekiński)51.

test T7E1

komórki lizowano w celu ekstrakcji genomu po transfekcji plazmidami gRNA i cas9 przez 60-72 godziny. miejsce docelowe gRNA Amplifikowano przy użyciu starterów PCR genomu (hIFITM3-GF1: AGGAAACT GTTGAGAAACCGAA; hIFITM3-GR1: GCTAGTGATAGCCGGGAC). Produkty PCR oczyszczano w żelu, a następnie denaturatowano i wyżarzano. Mieszaninę do wyżarzania traktowano endonukleazą T7 i przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a skuteczność rozszczepiania monitorowano za pomocą elektroforezy żelowej.

generacja i charakterystyka zmutowanych linii komórkowych IFITM przez CRISPR–Cas9

plazmid gRNA został skonstruowany przez wprowadzenie oligos gRNA do wektora pGL3-U6 poprzez ligację Golden Gate. Komórki transfekowano gRNA, pCas9 i pcDNA6-Puro w stosunku 1: 1: 0,1 (µg). Po 48 h komórki odłączono i podzielono na dwie części. Jedną część lizowano do testu T7E1 w celu sprawdzenia skuteczności rozszczepiania specyficznego gRNA; inną część ponownie umieszczano w płytkach o sześciu studzienkach w różnych rozcieńczalnikach. Dodano puromycynę w celu wybrania pozytywnych klonów. Po selekcji przez tydzień, oddzielone kolonie komórkowe zostały wybrane do nowej płytki 24-studzienkowej. Nowe kolonie komórkowe zostały rozszerzone i przeanalizowane przez western blot i sekwencjonowanie genomu w celu oceny skuteczności nokautowej.

do analizy western blot, komórki lizowano buforem lizy siarczanu dodecylu sodu (SDS) (2% SDS, 50 mM Tris, 2 mM EDTA) i gotowano przez 10 minut w temperaturze 98 °C. Dla immunoprecypitacji, komórki lizowano buforem Brij (0.1 mM trietanoloaminy (TEA), 150 mM NaCl, 1% BrijO10 (pH7, 4)) zawierającej mieszaninę inhibitorów proteazy bez EDTA, następnie inkubowaną z koralikami powinowactwa anty-HA (Sigma). Wszystkie przeciwciała pierwotne stosowano w rozcieńczeniu 1: 1 000, a przeciwciała wtórne w rozcieńczeniu 1:5 000.

dla sekwencjonowania genomowego klonów IFITM, całkowity Genom ekstrahowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomu z QIAGEN. Docelowe miejsce genomowe zostało wzmocnione przez genowe startery. Amplifikowane fragmenty dodano na końcu 3 ’ przez polimerazę taq, a następnie ligowano wektorami T. Po transformacji, dziesięć kolonii bakterii zostały wybrane losowo i wysłane do sekwencjonowania.

infekcje wirusowe

a549, hela, Vero (WHO) I Huh-7,5 komórki utrzymywały się w dmem uzupełnionym 10% FBS. Komórki A549 i HeLa wykorzystano w badaniach funkcjonalnych (testy replikacji wirusów), natomiast komórki Vero i Huh-7,5 wykorzystano do produkcji i miareczkowania wirusów. Wszystkie linie komórkowe testowane ujemnie na zakażenie mykoplazmą i zostały uzyskane z ATCC (z wyjątkiem Huh-7.5, który był z laboratorium Chisari (Scripps Research Institute, La Jolla, CA)).

komórki HeLa lub a549 zostały zakażone wirusem grypy a/PR/8/34 (H1N1) w czasie MOI 2,5 przez 12 godzin. zainfekowane komórki przemyto PBS i zebrano przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA. Komórki utrwalano w 3,7% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut i przenikano 0,1% Tritonem X-100 przez 10 minut. Komórki zabarwiono przeciwciałem nukleoproteiny przeciw grypie (np) (1:333; Abcam, ab 20343) i bezpośrednio skoniugowano z Alexa-Fluor 647 przy użyciu zestawu do znakowania przeciwciał 100 µg (Invitrogen). Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w 0,1% Triton X-100 w PBS i komórki barwiono przez 20 minut. Komórki przemyto dwukrotnie 0,1% Tritonem X-100 w PBS po każdym leczeniu przeciwciałami. PBS wykorzystano do ostatecznej resuspensji komórek do analizy cytometrycznej przy użyciu cytometru przepływowego FACS Canto II (BD Biosciences).

komórki HeLa lub a549 wysiewano do 24-studzienkowych płytek (5 × 104 komórki / studzienkę) i inkubowano przez noc (16 h) w obecności lub bez IFN-α1 w stężeniu 100 µg/mL. Następnie komórki przemywano Opti – mem (Gibco) przed zakażeniem. Wirusy rozcieńczano w Opti-MEM we wskazanych moi, a komórki szczepiono przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji inokulum wirusa usunięto, a Kultury przemyto trzykrotnie Opti-MEM przed ponownym dodaniem DMEM. Leczenie IFN-α1 kontynuowano przez cały czas trwania eksperymentów. Komórki zakażone wirusami znakowanymi GFP zebrano we wskazanych punktach czasowych w celu pomiaru zakażenia za pomocą cytometrii przepływowej. Wcześniej opisano wytwarzanie zapasów wirusowych dla następujących wirusów: YFV-Venus52 (otrzymany z yf17d-5 ’ 25venus2aubi), WNV-GFP53 (otrzymany z PBELO-WNV-GFP-RZ IC), DENV-GFP54 (otrzymany z IC30P-a, zakaźnego klonu szczepu 16681), VEEV-Gfp55 (otrzymany z zakaźnego klonu pTC83-GFP), ONNV-GFP56 (otrzymany z zakaźnego klonu pONNV.GFP) i VSV-GFP (J. Rose, Yale). ZIKV (PRVABC59) Collins) Amplifikowano w komórkach Huh – 7,5 i miareczkowano metodą płytki nazębnej na komórkach Huh – 7,5. Eksperymenty z WNV przeprowadzono w zabezpieczeniu na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i federalnymi. Zainfekowane komórki zebrano do 300 µl ośrodka dysocjacji komórek Accumax (eBioscience) i przeniesiono do 96-studzienkowego bloku zawierającego 300 µl 4% PFA. Komórki granulowano w temperaturze 930 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zawieszono w zimnym PBS zawierającym 3% FBS i przechowywano w temperaturze 4 °C do czasu analizy FACS. Komórki zakażone ZIKV pobrano w sposób opisany powyżej, a następnie zabarwiono za pomocą przeciwciała monoklonalnego przeciw antygenowi grupy flawiwirusów 4G2 (Millipore) w 1:500 jako przeciwciało pierwotne i przeciw Alexa-Fluor 594 w stosunku 1:1000 jako przeciwciało wtórne. Oprócz komórek zebrano supernatanty z zakażeń ZIKV w celu określenia miana wirusa za pomocą standardowego testu płytki nazębnej wykonanego na komórkach Huh-7,5. Wszystkie Próbki analizowano za pomocą cytometru przepływowego LSRII (BD Biosciences) wyposażonego w laser 488 nm i 561 nm do wykrywania GFP, yfp (Wenus) i RFP. Dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Treestar) z matrycą kompensacji 0,1%.

mikroskopia Fluorescencyjna

komórki hodowano na szklanych pokrywach w sześciostopniowych płytkach. Po zabiegu komórki przemyto dwukrotnie PBS, utrwalono 4% PFA przez 10 minut, permeabilizowano 0,2% Triton X-100 przez 10 minut, Zablokowano 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, Roche, 735094) przez 1 godzinę i inkubowano z pierwotnym przeciwciałem rabbit anti-IFITM3 (1:100 rozcieńczony w 1% BSA; Grupa Proteintech, 11714-1-AP) przez 1,5 godziny, a następnie wtórnym przeciwciałem anty-rabbit-Alexa Fluor 647 koniugat (1:1000; abcam, ab150083) przez 1 h W temperaturze pokojowej. Ostatecznie nakrywki zamontowano na szkiełkach za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI, a komórki zbadano za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM 780 (Zeiss).

egzogenne testy wychwytu ładunku

komórki zagłodzono w surowicy przez 45 minut w temperaturze 37 °C w DMEM, a następnie inkubowano na lodzie przez 5 minut, po czym dodano 50 µg/ml sprzężonej z Alexa-fluorem 647 transferryny (Invitrogenu) w DMEM. Po 30 min na lodzie komórki przeniesiono do temperatury 37 °C na 7 min lub 20 min, granulowano, przemyto w lodowatym PBS, przemyto kwasem (0.1 m glicyny i 150 mM NaCl przy pH 3) dwa razy, raz przemyto PBS i utrwalono (wt/obj. 3% PFA i 4% sacharozy w PBS) przed analizą cytometryczną przepływową, jak opisano powyżej.

Analiza wychwytu i redukcji dftat

synteza dftat (dimerycznego fluorescencyjnego TAT) przez Y.-C. Wanga została opisana jak poprzednio39. Po wstępnej obróbce z lub bez 100 µg/ml IFN-α przez 16 godzin, komórki inkubowano z 2 µM dfTAT w DMEM przez wskazany czas, umieszczano na lodzie i trzykrotnie przemywano lodowatym PBS i utrwalano (wt/obj.3% PFA i 4% sacharozy w PBS) przed przepływową analizą cytometryczną lub mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza obrotów EGFR i TfR

komórki hodowano do 80% zbiegu, przemyto dwa razy PBS i zagłodzono w dmem wolnym od surowicy przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu zmaksymalizowania powierzchniowego EGFR, a następnie wstępnie przygotowano 10-25 µg/ml cykloheksymidu przez 1 godzinę w dmem wolnym od surowicy, zapobiegając syntezie nowego EGFR podczas stymulacji przez EGF. Bezpośrednio po tym, komórki były stale stymulowane 100 ng / ml EGF przez 15, 30, 60 lub 120 minut w obecności cykloheksymidu. Poziomy EGFR i tubuliny oznaczano metodą Western blot. Do eksperymentów barwienia powierzchni komórki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem anty-EGFR (Abcam, ab32077) na lodzie przez 40 minut i przemyto trzy razy PBS. Przeciwciała wtórne sprzężone z Alexa-fluorem 647 (Abcam, ab150083) inkubowano z komórkami przez 40 minut na lodzie i przemyto trzy razy PBS. Komórki zawieszono w 2% FBS w PBS i natychmiast poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

w przypadku eksperymentów z obrotem TfR komórki hodowano do 80% zbiegu, przemyto dwa razy PBS i zagłodzono w dmem wolnym od surowicy przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie wstępnie poddano obróbce 10-25 µg/ml cykloheksymidu przez 1 godzinę w dmem wolnym od surowicy, zapobiegając syntezie nowego TfR. Bezpośrednio po tym, komórki były stale stymulowane 20 µg/ml Tf przez 0, 30, 60, 120 lub 180 minut w obecności cykloheksymidu. Poziomy TfR, IFITM3 i tubuliny oznaczono metodą Western blotting.

późny test fuzyjny endosomu i lizosomu

komórki inkubowano przez 4 godziny w pożywce hodowlanej zawierającej 25 µg/ml dekstranu Frodo-czerwonego, a następnie przez 20 godzin pościg w pożywce wolnej od fluoroforów w celu promowania lizosomalnej akumulacji dekstranu. Następnie komórki inkubowano w pożywce zawierającej 50 µg/ml dekstranu-Alexa Fluor 488 przez 10 minut w temperaturze 37 °C, przed zastąpieniem pożywką wolną od fluoroforów. W odnotowanych punktach czasowych komórki utrwalano lodowatym 4% PFA w celu barwienia immunofluorescencyjnego.

testy aktywności proteazy lizosomalnej

aktywność katepsyny B oznaczano za pomocą zestawu aktywności katepsyny B zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Po leczeniu IFN-α przez 16 godzin z bafilomycyną A1 lub bez niej, komórki inkubowano z magiczną czerwienią (1:26) przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyto dwukrotnie PBS. Następnie komórki utrwalano za pomocą 4% PFA i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.

etykietowanie katepsyn w oparciu o aktywność (Vergent Bioscience, Pan Cathepsin probe) zostało przeprowadzone, jak wcześniej opisano z niewielkimi modyfikacjami57. Krótko mówiąc, komórki wysiewano 24 h przed etykietowaniem, a komórki aktywowano IFN-α 16 h przed etykietowaniem. Pożywkę zastąpiono, a komórki potraktowano sondą katepsyny Pan 1 µM Iabp przez 2 godziny. komórki przemyto PBS i lizowano na lodzie buforem do lizy hipotonicznej (rury 50 mm pH 7,4, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mm EDTA, 4 mM DTT, 1% NP-40). Resztki komórek usunięto przez obracanie lizatów w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatanty następnie zmieszano z 4–krotnym buforem ładującym próbkę i 70 µg białka całkowitego analizowano za pomocą SDS-PAGE. Żel przemyto dwukrotnie wodą dejonizowaną przed analizą fluorescencji w żelu w systemie obrazowania Bio-Rad ChemiDoc MP i barwieniem Coomassie lub transferem do analizy western blot.

oznaczanie DiD wirusów

oczyszczony wirus grypy a/PR/8/34 (H1N1) i rekombinowany VSV z ekspresją LASV GPC (wygenerowany jak poprzednio opisany41) znakowano samoutwardzającymi stężeniami lipofilowego barwnika 1,1′-dioktaktadecylo-3,3,3′,3′-tetrametyloindodikarbocyjaniny (DiD, Life Technologies). Oczyszczony wirus (1 mg / ml) w PBS inkubowano z 50 µM DiD podczas mieszania przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wirus oddzielono od nadmiaru barwnika przez ultracentryfugację przez 10% poduszkę sacharozy przez 2 godziny w temperaturze 107 000 × g i 4 °C przy użyciu wirnika SW41 (Redlica Beckmana). Znakowane granulki wirusa zawieszono w PBS w stężeniu białka wirusowego 1 mg / ml, podzielono i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

etykietowanie Site-specific IFITM3 w komórkach ssaków

w badaniach obrazowania żywych komórek, komórki HeLa zostały zaszczepione na 35-mm naczyniach ze szklanym dnem, aby uzyskać około 70% zbiegu do obrazowania następnego dnia. Po przestrzeganiu zasad, komórki transfekowano plazmidem, który jest przedmiotem zainteresowania, zawierającym wariant oznaczający HA-IFITM3 (1 µg na naczynie) i plazmidem Mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA (1 µg na naczynie), stosując 3 µL Viafect (Promega) w pożywce do wzrostu komórek, zawierającej nienaturalne aminokwasy (tcok). Po nocnej inkubacji media komórkowe zamieniono w świeże media wzrostu komórek bez TCOK. Po kolejnej 2 h hodowli w 37 °C/5% CO2, komórki znakowano tetrazyno-fluoroforami (250 nM) w Fluorobrycie DMEM (technologie życia) przez 30 minut w 37 °C i przemyto kompletnymi pożywkami do wzrostu komórek trzy razy przez 1 godzinę.

obrazowanie żywych komórek

w przypadku mikroskopii epifluorescencyjnej o szerokim polu, komórki transdukowano wektorami światła komórkowego (technologie życia) dla wczesnych endosomów (RFP-Rab5), późnych endosomów (RFP-Rab7) lub lizosomów (RFP-LAMP1) około 18 godzin przed obrazowaniem, zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzono mikroskopię żywych komórek, jak opisano wcześniej za pomocą AxioObserver.Szerokokątny mikroskop epifluorescencyjny Z1 (Zeiss) wyposażony w Obiektyw 40 ×/ 1,3 N. A., zestaw filtrów dapi/GFP / Texas Red / Cy5 i ogrzewaną obudowę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 °C. Monowarstwy komórkowe HeLa były wysiewane na pokryte fibronektyną 35-mm szklane pokrywy naczynia (MatTek) 24 godziny przed eksperymentami. Komórki schłodzono na lodzie przez kilka minut przed spinokulacją wirusa znakowanego DiD na monowarstwy w temperaturze 1500 × g i 6 °C przez 20 minut. Niezwiązane cząstki usunięto przez pięć przemywania zimnym PBS i dodano 500 µl zimnego buforu obrazującego (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM sacharozy, 2 µM Hoechst 33342 i 2% FBS) w celu pokrycia komórek. Naczynie natychmiast zamontowano na obiektywie mikroskopu i skupiono. Naczynie coverslip zostało następnie zalane 1.5 ml ciepłego buforu do obrazowania, aby zaznaczyć początek eksperymentów (T = 0). Obrazy były uzyskiwane co 10 s w czasie trwania eksperymentów przy użyciu pojedynczego odcinka Z, który obejmował prawie wszystkie cząstki związane z komórką.

w mikroskopii konfokalnej komórki HeLa wysiewano w naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (ibidi) i hodowano przez noc. Następnego dnia komórki transfekowano interesującym plazmidem zawierającym wariant oznaczający ha-IFITM3 (1 µg na naczynie) i plazmidem Mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA (1 µg na naczynie) przy użyciu 6 µl Lipofektaminy 3000 w kompletnych podłożach wzrostu komórek zawierających TCOK. Po 16 h inkubacji media komórkowe zamieniono w świeże media wzrostu komórek bez TCOK. Po kolejnej 6 h hodowli w 37 °C/5% CO2, komórki znakowano TETRAZYNĄ-BODIPY (500 nM) W FluoroBrite dmem (Life Technologies)/10% FBS przez 0,5 h W 37 °C i przemyto FLUOROBRITE Dmem (Life Technologies)/10% FBS cztery razy przez 2 godziny. wreszcie, komórki barwiono NucBlue live Cell Stain (Life Technologies) przez 20 minut i zobrazowano w FluoroBrite dmem/10% FBS za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu barwienia błon plazmatycznych komórki barwiono na Czerwono CellMask (1:1000, Life Technologies) w Live Cell Imaging Solution (Lcis) przez 5 minut w temperaturze 37 °C i przemyto lcis trzy razy przed zabarwieniem NucBlue Live Cell Stain. Komórki zostały zobrazowane za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM 780 (Zeiss) z planem Zeissa-apochromatycznym obiektywem zanurzeniowym oleju 63×/1,4 N. A. Mikroskop został wyposażony w inkubator stage-top ustawiony w temperaturze 37 °C/5% CO2 do obrazowania żywych komórek. Hoechst był wzbudzany laserem o długości fali 405 nm z widmami emisyjnymi zebranymi między 410 nm A 480 nm. Tz-BODIPY był wzbudzany laserem o długości fali 488 nm z widmami emisyjnymi zebranymi pomiędzy 490 nm a 550 nm. CellMask Red był wzbudzany laserem 561 nm z widmami emisyjnymi zebranymi między 570 nm a 620 nm. Obrazy zostały pozyskane za pomocą oprogramowania ZEN blue 2012 (Zeiss) i przeanalizowane przez ImageJ (NIH). Współczynniki korelacji Pearsona zostały obliczone w ImageJ za pomocą wtyczki Coloc 2.

analiza danych

analiza obrazu i śledzenie pojedynczych cząstek zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer), jak opisano poprzednio41. Pliki graficzne nie były manipulowane, oprócz drobnych korekt jasności i kontrastu. Wirus puncta był progresji początkowej intensywności i wielkości. Puncta mieszczące się poza zakresem 0,25 do 1 µm2 oczekiwane dla pojedynczych wirionów znakowanych DiD zostały wyłączone z analizy pojedynczych cząstek. Wiriony zostały uznane za kolokalizowane LAMP1 lub IFITM3 tylko wtedy, gdy marker komórkowy punctum przekroczył sygnał tła o 30% lub więcej i jeśli GFP lub BODIPY i puncta współwystępowały z ponad 70% pokrywaniem się sygnałów. Średnie pomiary (± s.d.) pochodzą z trzech oddzielnych eksperymentów, o ile nie zaznaczono inaczej.

Analiza poziomów ekspresji HA-IFITM3-TCOK

w celu analizy western blot, komórki HeLa wysiewano w płytkach o sześciu studzienkach i hodowano przez noc. Komórki Ifitm2/3-KO transfekowano HA-IFITM3-F8TAG (2,5 µg) I Mm-PylRS-Af / Pyl-tRNACUA (2,5 µg) w obecności TCOK (50 µM) przez 16 godzin. komórki Hela WT nieleczono lub poddano działaniu IFN-α (100 ng/ml) przez 16 godzin. poziomy IFITM3 oznaczano metodą Western blotting z zastosowaniem króliczego anty-ifitm3 (1: 1000; Grupa Proteintech, 11714-1-AP) i wtórne przeciwciało sprzężone z HRP koziego anty-króliczego IgG (HCL; 111-035-003).

do analizy immunofluorescencji, komórki IFITM2/3-KO transfekowano HA-IFITM3-F8TAG (1 µg) I Mm-PylRS-Af/Pyl-tRNACUA (1 µg) w obecności TCOK (50 µM) przez 16 godzin. komórki Hela WT nie leczono lub traktowano IFN-α (100 ng/ml) przez 16 godzin. następnie komórki utrwalano formaldehydem, permeabilizowano saponiną (100 ng / ml). 0, 5%) i immunostained króliczym anty-ifitm3 (1:100) (Grupa PROTEINTECH, 11714-1-AP) i anty-króliczym-Alexa fluor 647 koniugat (1:1000) (Abcam, ab150083) do konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego. Hoescht (niebieski) służy do barwienia jąder. Komórki zostały zobrazowane za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM 780 (Zeiss) z obiektywem zanurzeniowym Zeiss Plan-Apochromatic 63× / 1,4. Zdjęcia wykonano pod identycznym mikroskopem konfokalnym.

do analizy cytometrii przepływowej komórki IFITM2/3 KO transfekowano HA-IFITM3-F8TAG (1 µg), Mm-PylRS-af//Pyl-tRNACUA (1 µg), w obecności TCOK (50 µM) przez 16 godzin. komórki Hela WT traktowano IFN-α (100 ng / ml) lub bez niego przez 16 godzin. Komórki przemywano dwukrotnie PBS, a następnie utrwalano 400 µl PBS z 4% PFA przez 10 minut. Stałe komórki przenikano 200 µl 0,2% saponiny w PBS przez 10 minut, a następnie blokowano 200 µl 0,2% BSA i 0,2% saponiny w PBS przez 10 minut. Komórki leczono króliczym anty-IFITM3 (1:300) (Grupa Proteintech, 11714-1-AP) i anty-króliczym-Alexa Fluor 647 (1:1000) (Abcam, ab150083) w PBS z 0,02% saponiną. Po trzech płukaniach PBS, komórki zawieszono w 150 µL PBS z 0,2% BSA i 0,02% saponiny. Próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej (BD LSRII). Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FLowJo.

zakażenie IAV mutantami Cys Ifitm3

komórki HeLa IFITM2/3 KO zaszczepiono w 12 płytkach (Corning) i hodowano przez noc. Komórki Ko transfekowano konstruktami HA-hIFITM3 (1 µg / studzienkę) i plazmidem Mm-PylRS-AF / Pyl-tRNA (1 µg/studzienkę) przy użyciu 3 µl Lipofektaminy 3000 W 1 ml kompletnego pożywki do wzrostu komórek zawierającej 10 µl 100 mM BocK (stężenie końcowe 1 mM). Po 16 godzinach komórki zostały zakażone wirusem grypy a/PR/8/34 (H1N1) z MOI 5. Po 6 godzinach infekcji komórki trypsynizowano i zebrano w probówkach klastrowych (Corning). Komórki przemywano dwukrotnie PBS, a następnie utrwalano 400 µl PBS z 4% PFA przez 10 minut. Stałe komórki przenikano 200 µl 0,2% saponiny w PBS przez 10 minut, a następnie blokowano 200 µL 0,2% BSA i 0,2% saponiny w PBS przez 10 minut. Komórki leczono przeciwciałem przeciw grypie np sprzężonym z Alexafluorem-647 i przeciwciałem anty-HA sprzężonym z Alexa-fluorem-594 (1:250) w PBS z 0,02% saponiną. Po trzech płukaniach PBS, komórki zawieszono w 150 µl PBS z 0,2% BSA i 0.02% saponiny. Próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej (BD LSRII). Wszystkie próbki najpierw ogrodzono barwieniem HA-dodatnim, wskazującym na udaną transfekcję, a następnie NP-dodatnim odsetkiem barwienia np-dodatnim, wskazującym na udaną infekcję. Epitop ha-tag pochodzi ze szczepu wirusa grypy H3 i nie występuje w szczepie PR8 wirusa grypy H1N1. Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FLowJo.

testy s-palmitoilacji

oznaczanie metaboliczne komórek reporterem kwasu alkinowo-palmitynowego alk-16 przeprowadzono zgodnie z opisem poprzednio 58 z pewnymi modyfikacjami. ALK-16 i az-Rho zostały zsyntetyzowane zgodnie z wcześniejszymi zgłoszeniami58. Komórki HeLa IFITM2/3 KO transfekowano konstruktami HA-hIFITM3, jak opisano powyżej. Po 16 godzinach komórki inkubowano z 50 µM alk-16 w DMEM zawierającym 10% FBS przez 2 godziny. komórki pobrano, przemyto raz PBS i lizowano w 1% Brij 97 (Sigma) w 50 mm TEA, 150 mM NaCl pH 7,4, 1x inhibitor proteazy Roche i 1500 jednostek/ml benzonazy (EMD). Stężenia białek oznaczano metodą BCA. Do immunoprecypitacji dodano 150 µg białka całkowitego do 20 µl agarozy sprzężonej z przeciwciałami anty-HA (Sigma) w całkowitej objętości 150 µl i kołysano w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. kulki Agarozowe przemyto przez wymieszanie w 500 µl buforu HEPES 50 mM (zawierającego 150 mM NaCl, pH 7,4) przez odwirowanie w 3500 × g przez 30 s. kulki następnie wymieszano w 45 µl powyższego buforu i 5 µl roztworu reagenta cuaac (0.Dodano 5 µl 10 mM azydo-rodaminy (stężenie końcowe 100 µM), 1 µl 50 mM świeżo przygotowanego CuSO4·5H2O w H2O (stężenie końcowe 1 mM, Sigma), 1 µl 50 mM świeżo przygotowanego TCEP (stężenie końcowe 1 mM) i 2,5 µl 10 mM Trisaminy (TBTA) (stężenie końcowe 500 µM)). Próbki kołysano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i dwukrotnie przemyto buforem RIPA. Do próbek dodano bufor Laemmli (20 µl) (stosunek buforu do próbki 1,0:1,3), które ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 95 °C i oddzielano elektroforezą żelową. Skanowanie fluorescencyjne w żelu przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania Bio-Rad ChemiDoc MP. Western blots dla białek znakowanych HA przeprowadzono stosując przeciwciało sprzężone anty-HA HRP (1: 1000; Roche). Oznaczanie intensywności pasma w żelach fluorescencyjnych i blotach zachodnich przeprowadzono w laboratorium obrazowym (Bio-Rad). Dane z trzech replikatów biologicznych oznaczono ilościowo i uśredniono dla Wykresów.

podsumowanie sprawozdania

więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu sprawozdania z badań przyrodniczych połączonym z tym artykułem.

Posted on

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.