iGluSnFr fluoreseert met glutamaatinvoer en meet neuronale communicatieIn een vorige blogpost hebben we besproken hoe fluorescente eiwitten kunnen worden gebruikt om biosensoren te bouwen, biologische instrumenten die processen monitoren of moleculen detecteren. Hier duiken we in de details rond SF-iGluSnFr, een recent verbeterde biosensor ontworpen om glutamaat te detecteren.

the origins of iGluSnFr

iglusnfr fluoresces with glutamate bindingiGluSnFr werd in 2013 ontwikkeld door het lab van Loren Looger om onderzoekers de mogelijkheid te geven om glutamaatvrijgave uit neuronen en andere hersencellen in vivo te monitoren. Glutamaat speelt een verscheidenheid van rollen in synaptische mededeling en kan andere vormen van neuronaal signaleren en regelgeving teweegbrengen.

om iGluSnFr te creëren, klemde het Loogerlaboratorium GFP tussen twee helften van een bacterieel afgeleid periplasmisch glutamaatbindend eiwit bekend als GltI. Wanneer de resulterende fusieproteã Ne aan glutamaat bindt, conformational veranderingen leiden tot een verhoging van fluorescentieintensiteit van ingevoegde GFP.

na het karakteriseren van iGluSnFr in vitro, waaruit bleek dat het selectief wordt geactiveerd door glutamaat, en het aanpassen om zijn reactievermogen te verbeteren, toonde het Looger lab aan dat iGluSnFr neuronale activiteit kon detecteren bij C. elegans, zebravis en muizen.

Download het fluorescente proteïnen 101 eBook

Upgrades naar iGluSnFr

hoewel een nuttig hulpmiddel, was deze eerste versie van iGluSnFr niet optimaal voor experimenten die hoge signaal-ruisverhoudingen of beeldvorming van hoogfrequente glutamaatsignaalgebeurtenissen vereisen. Het Looger lab verbeterde daarom op iGluSnFr op 3 belangrijke manieren die hier worden beschreven. De onderzoekers deden het volgende:

  1. verhoogde helderheid van iGluSnFr
  2. creëerde nieuwe iglusnfr-varianten met verschillende glutamaatbindingskinetiek
  3. gecreëerde blauwe en gele iGluSnFr-varianten

vind hier de SF-iGluSnFr-plasmiden!

verhoogde helderheid

in hun eerste overstap naar iGluSnFr wisselden Marvin et al eGFP voor sfGFP om SF-iGluSnFr te creëren. Deze verbeterde variant heeft hogere uitdrukkingsniveaus in bacteriën en en produceert uiteindelijk sterkere fluorescente signalen op het ontdekken van glutamaat in muis en fret modellen.

verhoogde veelzijdigheid door gevarieerde glutamaatbindingskinetiek

glutamaattitratie voor iglusnfr-varianten hoewel de oorspronkelijke iGluSnFr een fysiologisch relevante 4 µM-affiniteit voor glutamaat in celcultuur had, beïnvloedde dit relatief lage niveau van affiniteit de prestaties in de volgende settings:

  1. experimentele opstellingen die detectie van laagfrequente signalen, verhoogde affiniteit en hoge signaal-ruisverhoudingen
  2. Identificatie van discrete, hoogfrequente gebeurtenissen vereisen-deze vereisen een lagere affiniteit (door snellere off-rates) om signalen van individuele gebeurtenissen

te identificeren om deze problemen op te lossen muteerden Marvin et al een gebied van het iglusnfr-fusie-eiwit waarvan bekend is dat het belangrijk is voor de affiniteit. Mutatie van dit zogenaamde “scharniergebied” resulteerde in de identificatie van twee nuttige varianten:

  • SF-iGluSnFr.A184S (verhoogde affiniteit voor glutamaat)
  • SF-iGluSnFr.S72A (verminderde affiniteit voor glutamaat)

Marvin et al. verder tonen aan dat de a184s variant een intenser fluorescerend signaal in reactie op lagere concentraties van glutamaat in vergelijking met iGluSnFr produceert. De variant S72A daarentegen, is beter bij het ontdekken van herhaalde hoge frequentiegebeurtenissen zoals neuronale glutamaatversie op elektrostimulatie. Met deze varianten kunnen onderzoekers de specifieke tool kiezen die het beste past bij hun experimentele behoeften.

nieuwe SF-iGluSnFr-kleuren

De oorspronkelijke iGluSnFr had slechts één kleur: groen. Een onderzoeker zou meer kleuren nodig kunnen hebben om afzonderlijke signalerende gebeurtenissen in nabijgelegen cellen in beeld te brengen of om glutamaat gemakkelijk te identificeren die in specifieke celtypes signaleren. Marvin et al ruilden daarom onze chromophore GFP in iGluSnFr en optimaliseerden de GltI-fluorescente eiwitverbanden waar nodig om blauwe (SF-Azurite-iGluSnFr) en gele (SF-Venus-iGluSnFr) varianten te produceren. Inderdaad, naast het toevoegen van nieuwe kleuren, kan de gele variant ook worden afgebeeld door goedkope 1030 nm twee foton femtoseconde lasers die meerdere gebieden kunnen prikkelen in een enkel monster. Met deze SF-iGluSnFr-constructies hebben wetenschappers zowel nieuwe iGluSnFr-kleuren als nieuwe manieren om ze te prikkelen!

gebruik van SF-iGluSnFr in uw laboratorium

De nieuwe SF-iGluSnFr-varianten moeten wetenschappers in staat stellen signaalgebeurtenissen in de hersenen en daarbuiten robuust te detecteren. Het Looger lab richt zich op SF-iGluSnFr toepassingen in de neurobiologie in de hier besproken papers, maar, zoals ze vermelden in hun 2013 werk, glutamaat signalering komt voor in vele contexten en kan nuttig zijn voor wetenschappers die werken in organismen variërend van bacteriën tot dieren tot planten.

De SF-iGluSnFr-varianten zijn beschikbaar in AAV-vectoren die beschikbaar zijn bij Addgene. Het Looger Lab heeft een kort overzicht gegeven van de promotor systemen die u kunt gebruiken om de SF-iGluSnFr varianten uit te drukken.:

    • CAG: Generieke sterke promotor. Geformuleerd als AAV-DJ voor neuronale expressie.
    • CAG-FLEX: CAG-promotor, gebogen voor expressie in Cre-expressiecellen.
    • hSynap: humaan synapsine-1 promotor. Goed voor neuronale expressie.
    • hSynap-FLEX: synanpsine-1-promotors, gebogen voor expressie in Cre-expressiecellen.
    • GFAP: Glialfibrillair zuur eiwit (promotor). Goed voor Gliall expressie (geen neuronen).

we zijn blij om te zien hoe u deze geweldige nieuwe tools te gebruiken!

Download het Viral Vectors 101 eBook

1. Marvin, Jonathan S., et al. “Stabiliteit, affiniteit en chromatische varianten van de glutamaat sensor iGluSnFR.”Nature Methods (2018): 936-939. PubMed PMID: 30377363.

vind de SF-iGluSnFr plasmiden hier!

2. Marvin, Jonathan S., et al. “Een geoptimaliseerde fluorescente sonde voor het visualiseren van glutamaat neurotransmissie.”Nature methods10. 2 (2013): 162. PubMed PMID: 23314171. PubMed Central Pmcid: PMC4469972.

Additional Resources on the Addgene Blog

  • meer informatie over andere Fluorescerende biosensoren
  • een praktische aanpak voor het kiezen van het fluorescerende eiwit (rechts)
  • bezoek de themapagina voor Fluorescerende eiwitten

Posted on

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.