iGluSnFr fluorescerer med glutamatinngang og måle nevronkommunikasjon i et tidligere blogginnlegg diskuterte vi hvordan fluorescerende proteiner kan brukes til å konstruere biosensorer, biologiske verktøy som overvåker prosesser eller oppdager molekyler. Her dykker vi inn i detaljene rundt SF-iGluSnFr, en nylig oppgradert biosensor designet for å oppdage glutamat.

opprinnelsen til iGluSnFr

iglusnfr fluorescerer med glutamatbindingIglusnfr ble utviklet i 2013 Av Loren Loogers laboratorium for å gi forskere muligheten til å overvåke glutamatfrigivelse fra nevroner og andre hjerneceller in vivo. Glutamat spiller en rekke roller i synaptisk kommunikasjon og kan utløse andre former for nevronal signalering og regulering.

For å skape iGluSnFr klemte Looger-laboratoriet GFP mellom to halvdeler AV Et bakterielt avledet periplasmisk glutamatbindende protein kjent som GltI. Når det resulterende fusjonsproteinet binder seg til glutamat, fører konformasjonsendringer til en økning i fluorescensintensiteten fra den innsatte GFP.

Etter å ha karakterisert iGluSnFr in vitro, som viste at den selektivt aktiveres av glutamat, og tweaking det for å forbedre sin respons, viste Looger lab at Iglusnfr kunne oppdage nevronaktivitet I c. elegans, sebrafisk og mus.

Last Ned Fluorescerende Proteiner 101 ebok

Oppgraderinger til iGluSnFr

selv om et nyttig verktøy, var denne første versjonen av Iglusnfr ikke optimal for eksperimenter som krever høye signal til støyforhold eller avbildning av høyfrekvente glutamat signaleringshendelser. Looger lab derfor forbedret på iGluSnFr i 3 store måter detaljert her. Forskerne gjorde følgende:

  1. Økt iglusnfr lysstyrke
  2. Opprettet nye iglusnfr varianter Med ulike glutamat bindende kinetikk
  3. Opprettet blå og gul farge iglusnfr varianter

Finn SF-IGLUSNFR Plasmider her!

økt lysstyrke

i sin første endring til iGluSnFr, marvin et al byttet eGFP for sfGFP å skape SF-iGluSnFr. Denne forbedrede varianten har høyere ekspresjonsnivåer i bakterier og produserer til slutt sterkere fluorescerende signaler ved sensing av glutamat i mus-og ferretmodeller.

økt allsidighet gjennom variert glutamatbindingskinetikk

 glutamattitrering for iglusnfr-varianter selv om den opprinnelige iglusnfr hadde en fysiologisk relevant 4 µ affinitet for glutamat i cellekultur, påvirket dette relativt lave affinitetsnivået ytelsen i følgende innstillinger:

  1. Eksperimentelle oppsett som krever lavfrekvent signaldeteksjon, økt affinitet og høye signal til støyforhold
  2. Identifisering av diskrete høyfrekvente hendelser – disse krever lavere affinitet (gjennom raskere off-priser) for å identifisere signaler fra individuelle hendelser

for å overvinne disse problemene muterte Marvin et al en region av iglusnfr-fusjonsproteinet kjent for å være viktig for affinitet. Mutasjon av denne såkalte «hengselregionen» resulterte i identifisering av to nyttige varianter:

  • SF-iGluSnFr.A184S (økt affinitet for glutamat)
  • SF-iGluSnFr.S72A (redusert affinitet for glutamat)

Marvin et al. videre viser AT a184s-varianten gir et mer intenst fluorescerende signal som respons på lavere konsentrasjoner av glutamat sammenlignet med iGluSnFr. S72A-varianten derimot, er bedre til å oppdage gjentatte høyfrekvente hendelser som neuronal glutamatfrigivelse ved elektrisk stimulering. Med disse variantene kan forskerne velge det spesifikke verktøyet som best passer deres eksperimentelle behov.

Nye SF-iGluSnFr farger

den opprinnelige iGluSnFr bare kom i en farge – grønn. En forsker kan trenge flere farger for å vise separate signaleringshendelser i nærliggende celler eller for enkelt å identifisere glutamatsignalering i bestemte celletyper. Marvin et al derfor byttet vår gfp chromophore i iGluSnFr og optimalisert GltI-fluorescerende protein bindinger der det er nødvendig å produsere blå (SF-Azurite-iGluSnFr) og gul (sf-Venus-iGluSnFr) varianter. Faktisk, utover å legge til nye farger, kan den gule varianten også avbildes av billige 1030 nm to foton femtosekund lasere som kan opphisse flere områder i en enkelt prøve. Med DISSE SF-iGluSnFr-konstruksjonene har forskere både nye iglusnfr-farger og nye måter å opphisse dem på!

Bruk AV SF-iGluSnFr i laboratoriet

de nye sf-iglusnfr-variantene skal gjøre det mulig for forskere å robust oppdage signalhendelser i hjernen og utover. Looger lab fokuserer PÅ SF-iGluSnFr-applikasjoner i nevrobiologi i papirene diskutert her, men som de nevner i deres 2013-arbeid, forekommer glutamat signalering i mange sammenhenger og kan være nyttig for forskere som arbeider i organismer som spenner fra bakterier til dyr til planter.

SF-iGluSnFr-variantene kommer I aav-vektorer tilgjengelig Fra Addgene. Looger Lab har gitt en kort oversikt over promotersystemene du kan bruke til å uttrykke sf-iGluSnFr-varianter:

    • Cag: Generisk sterk promoter. Formulert SOM AAV-DJ for neuronal uttrykk.
    • CAG-FLEX: cag promoter, Bøyd for uttrykk i Cre-uttrykke celler.
    • hSynap: Human Synapsin – 1 promotør. Bra for nevronale uttrykk.
    • Hsynap-FLEX: Synanpsin-1-promotorer, Bøyd for uttrykk i Cre-uttrykksceller.
    • GFAP: Glialfibrillært surt protein (promoter). Bra For Gliall uttrykk (ikke nevroner).

vi er glade for å se hvordan du bruker disse flotte nye verktøyene!

 Last Ned Virale Vektorer 101 ebok

1. Marvin, Jonathan S., et al. «Stabilitet, affinitet og kromatiske varianter av glutamat sensor iGluSnFR.»Natur Metoder (2018): 936-939 . PubMed PMID: 30377363.

Finn SF-Iglusnfr Plasmider her!

2. Marvin, Jonathan S., et al. «En optimalisert fluorescerende sonde for å visualisere glutamat nevrotransmisjon.»Naturmetoder10. 2 (2013): 162 . PubMed PMID: 23314171. PubMed Sentral PMCID: PMC4469972.

Ytterligere Ressurser På Addgene Bloggen

  • Lær om Andre Fluorescerende Biosensorer
  • En Praktisk Tilnærming Til Å Velge B(høyre)est Fluorescerende Protein
  • Besøk Fluorescerende Protein Featured Emneside

Posted on

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.