Cellelinjer og reagenser

Både HeLa og A549 celler ble bestilt fra Atcc og dyrket I Dulbeccos Modifiserte Eagle ‘ S Medium (DMEM, Gibco 12800-017) som inneholder 10% Fbs (Hyklon SN30087.02). Antistoffene IFITM1, IFITM2 og IFITM3 ble bestilt fra Cell Signaling Technology (13126 S), Proteintech group (66137-1-ig) og Abgent (AP1153a). Anti-IFITM3 (polyclonal) 10088-604 var FRA VWR International. EGFR-antistoff var Fra Abcam (ab32077). TfR-antistoff var Fra R& D-systemer (AF2474). Alexa-Fluor 488-CD63 (sc-5275) var Fra Santa Cruz Bioteknologi. Influensa a-virus nukleoprotein antistoff (ab20343) var Fra Abcam. Alexa-Fluor 647 Antistoffmerkingssett (A20186) ble bestilt fra Life Technologies. De sekundære antistoffene HRP-konjugert geit anti-mus IgG (HCL) (115-035-003) OG HRP-konjugert geit anti-kanin IgG (HCL) (111-035-003) ble kjøpt fra Jackson ImmunoResearch. Sau IgG pepperrot peroxidase-konjugert antistoff (#HAF016) ble bestilt Fra Fisher Scientific. Anti-HA antistoff konjugert Til Alexa-Fluor 594 ble kjøpt fra Life Technologies. Anti-HA HRP-konjugert antistoff ble bestilt Fra Roche. Anti-calnexin (ab22595) var Fra Abcam. Dextran-Alexa-Fluor 488 (D22910), dextran-pHrodo-rød (P10361), transferrin-Alexa-Fluor 647 (T23366) og rekombinant HUMAN EGF (10605HNAE25) var Fra Life Technologies. Human holo-Transferrin (T0665) var Fra Sigma-Aldrich. Humant interferon-α (IFN-α, 8927SC) var Fra Cellesignalteknologi. Influensa A/PR/8 / 34 (H1N1) (10100374) var Fra Charles River Laboratories. Magic Red Cathepsin B Assay Kit (937) var Fra Immunokjemi Teknologier. Bafilomycin A1 (ab120497) var Fra Abcam. 6-TAMRA, Spesiell Formulering (6-karboksytetrametylrhodamin, AS-81122) var FRA ANASPEC. QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (#200523) var Fra Agilent Technologies. T7 Endonuklease I (M0302S) var Fra New England BioLabs.

Plasmider

pEF-IFITM1, IFITM2, IFITM3 ble klonet VED PCR-forsterkning og satt inn i en pef6-bsd-vektor. ALLE mutanter AV IFITM3 ble generert ved Hjelp Av QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). PCAS9 plasmid og gRNA basic vector (pGL3-U6) var gaver Fra W. Wei (Peking University)51.

t7e1-analyse

Celler ble lysert for genomutvinning etter transfeksjon med gRNA og cas9 plasmider for 60-72 h. gRNA-målstedet ble forsterket ved bruk av genom PCR-primere (hIFITM3-GF1: AGGAAACT GTTGAGAAACCGAA; hIFITM3-GR1: GCTAGTGGATAGCCGGGAC). PCR-produktene ble gelrenset, etterfulgt av denaturering og glødning. Glødemiddelblandingen ble behandlet Med T7 endonuklease I i 15 min ved 37 °C, og spaltningseffektiviteten ble deretter overvåket ved gelelektroforese.

Generering OG karakterisering AV IFITM mutantcellelinjer VED CRISPR–Cas9

gRNA plasmid ble konstruert ved å sette inn gRNA oligos i en pgl3-U6 vektor Gjennom Golden Gate ligering. Cellene ble transfisert med gRNA, pCas9 og pcDNA6-Puro med et forhold på 1: 1: 0,1 (µ). Etter 48 h ble celler løsrevet og delt i to deler. En del ble lysert FOR t7e1-analyse for å kontrollere spaltningseffektiviteten til spesifikk gRNA; en annen del ble reseeded i seks brønnplater ved forskjellige fortynninger. Puromycin ble tilsatt for å velge de positive klonene. Etter utvelgelse i en uke ble de separerte cellekoloniene plukket ut i en ny 24-brønnplate. Nye cellekolonier ble utvidet og analysert ved western blot og genomsekvensering for å evaluere knockout-effektiviteten.

for western blot-analyse ble cellene lysert med natriumdodecylsulfat (sds) lysebuffer (2% SDS, 50 mM Tris, 2 mM EDTA) og kokt i 10 minutter ved 98 °c. for immunopresipitasjon ble cellene lysert Med Brij-buffer (0.1 mM trietanolamin (TE), 150 mM NaCl, 1% BrijO10 (pH7.4)) som inneholder EDTA-fri proteasehemmerblanding, deretter inkubert med anti-HA affinitetsperler (Sigma). Alle primære antistoffer ble brukt ved en fortynning på 1:1000, og sekundært antistoff ble brukt ved 1:5000.

for genomisk sekvensering AV IFITM-kloner ble totalt genom ekstrahert ved hjelp AV et genomekstraksjonssett FRA QIAGEN. Målet genomiske området ble forsterket av gen-spesifikke primere. De forsterkede fragmentene ble tilsatt ved 3 ‘ – enden av taq-polymerase og deretter ligert Med T-vektorer. Etter transformasjon ble ti bakteriekolonier plukket tilfeldig og sendt for sekvensering.

Virusinfeksjoner

a549, HeLa, Vero (WHO) og Huh-7,5 celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS. A549-og HeLa-celler ble brukt i funksjonelle studier (virusreplikasjonsanalyser), Mens Vero-og Huh-7,5-celler ble brukt til virusproduksjon og virustitrering. Alle cellelinjer testet negativt for forurensning med mykoplasma og ble hentet fra Atcc (Med unntak Av Huh-7.5, som var Fra chisari lab (Scripps Research Institute, La Jolla, CA)).

HeLa-eller A549-celler ble infisert med influensa a/PR/8 / 34-virus (H1N1) ved EN MOI på 2,5 for 12 h. Infiserte celler ble vasket MED PBS og høstet ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA. Cellene ble festet i 3,7% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter og gjennomsyret med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter. Cellene ble farget med anti-influensa nukleoprotein (NP) antistoff (1: 333; Abcam, ab 20343) og direkte konjugert Til Alexa-Fluor 647 ved hjelp av en 100 µ antistoff merking kit (Invitrogen). Alle antistoffer ble fortynnet i 0,1% Triton X-100 I PBS, og celler ble farget i 20 min. Cellene ble vasket to ganger med 0,1% Triton X-100 i PBS etter hver antistoffbehandling. PBS ble brukt til endelig resuspensjon av celler for cytometrisk analyse ved HJELP AV ET FACS Canto II flowcytometer (BD Biosciences).

HeLa-eller A549-celler ble sådd i 24 brønnplater (5 × 104 celler/brønn) og inkubert over natten (16 timer) ved TILSTEDEVÆRELSE ELLER fravær AV IFN-α1 i en konsentrasjon på 100 µ/mL. Deretter ble cellene vasket Med Opti-Mem (Gibco) før infeksjon. Virus ble fortynnet I Opti-MEM ved indikert MOIs, og celler ble inokulert i 2 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon ble viral inokulum fjernet, og kulturer ble vasket tre ganger med Opti-MEM før DMEM ble re-tilsatt. BEHANDLING MED IFN-α1 ble videreført gjennom forsøkene. Celler infisert MED GFP-merkede virus ble høstet på angitte tidspunkter for å måle infeksjon ved flowcytometri. Genereringen av virale bestander for følgende virus har tidligere blitt beskrevet: YFV-Venus52 (avledet FRA YF17D-5 ‘ C25venus2aubi), WNV-GFP53 (avledet fra pBELO-WNV-GFP-rz ic), DENV-GFP54 (avledet FRA IC30P-A, en full lengde infeksiøs klon av stamme 16681), VEEV-GFP55 (avledet fra pTC83-GFP infeksiøs klon), ONNV-GFP56 (avledet fra FRA SMITTSOM KLON ponnv.GFP) og VSV-GFP (generøst levert Av J. Rose, Yale). ZIKV (PRVABC59 hentet fra CDC, Ft. Collins) ble forsterket I Huh-7,5 celler og titret av plaque assay På Huh-7,5 celler. Eksperimenter med WNV ble utført i biosikkerhet nivå 3 (BSL3) containment i samsvar med institusjonelle og føderale retningslinjer. Infiserte celler ble høstet inn i 300 µ Accumax celledissosiasjonsmedium (eBioscience) og overført til en 96-brønnsblokk inneholdende 300 µ 4% PFA. Cellene ble pelletert ved 930 r.c. f. i 5 min ved 4 °C, resuspendert i kalde PBS inneholdende 3% FBS, og lagret ved 4 °C TIL FACS analyse. Celler infisert MED ZIKV ble høstet som beskrevet ovenfor og deretter farget ved hjelp av et monoklonalt antistoff FOR flavivirus gruppe antigen 4G2 (Millipore) ved 1:500 som et primært antistoff og Anti-kanin Alexa-Fluor 594 ved 1: 1000 som et sekundært antistoff. I tillegg til celler ble supernatanter fra ZIKV-infeksjoner høstet for å bestemme virale titere ved standard plakkanalyse utført På Huh-7.5-celler. Alle prøvene ble analysert VED HJELP AV lsrii flow cytometer (BD Biosciences) utstyrt med en 488 nm og en 561 nm laser for påvisning AV GFP, Yfp (Venus) og RFP. Data ble analysert Ved Hjelp Av FlowJo software (Treestar) med en 0,1% kompensasjonsmatrise.

Fluorescensmikroskopi

Celler ble dyrket på glassdeksler i seks brønnplater. Etter behandling ble cellene vasket med PBS to ganger, festet med 4% PFA i 10 min, permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i 10 min, blokkert med 1% bovint serumalbumin (BSA, Roche, 735094) i 1 time, og inkubert med primært antistoff kanin anti-IFITM3 (1:100 fortynnet i 1% Bsa; Proteintech group, 11714-1-AP) i 1,5 timer, etterfulgt av sekundært antistoff anti-kanin-Alexa fluor 647 konjugert (1:1000; ABCAM, ab150083) i 1 time Ved Romtemperatur. Til slutt ble dekslene montert på lysbilder ved hjelp av monteringsmedium som inneholdt DAPI, og cellene ble undersøkt av invertert lsm 780 laser scanning confocal microscope (Zeiss).

eksogene opptakstester for last

Cellene ble serumsultede i 45 min ved 37 °C I DMEM og ble deretter inkubert på is i 5 min, som ble etterfulgt av tilsetning av 50 µ/ml Alexa-Fluor 647-konjugert transferrin (Invitrogen) i DMEM. Etter 30 min på is ble cellene overført til 37 °C i 7 min eller 20 min, pelletert, vasket i iskald PBS, syrevasket (0.1 m glysin og 150 mM NaCl ved pH 3) to ganger, vasket med PBS en gang, og fast (wt / vol 3% PFA og 4% sukrose I PBS) før flowcytometrisk analyse, som beskrevet ovenfor.

Analyse av dfTAT opptak og reduksjon

Syntese av dfTAT (dimerisk fluorescerende tat) Av Y.-C. Wang var som tidligere beskrevet39. Etter forbehandling med ELLER uten 100 µ/ml IFN-α I 16 t ble cellene inkubert med 2 µ dftat i DMEM for angitt tid, plassert på is og vasket av iskald PBS tre ganger, og fast (wt/vol 3% PFA og 4% sukrose I PBS) før flowcytometrisk analyse eller fluorescensmikroskopi.

Analyse AV egfr-og Tofr-omsetning

Celler ble dyrket til 80% konfluens, vasket to ganger med PBS og sultet i serumfri DMEM i 2 timer ved 37 °C for å maksimere overflaten EGFR og deretter forbehandlet med 10-25 µ / ml cykloheksimid i 1 time i serumfri DMEM, og forhindret syntese av NY EGFR under stimulering MED EGF. Umiddelbart etter ble cellene kontinuerlig stimulert med 100 NG / ml EGF for 15, 30, 60 eller 120 min i nærvær av cykloheksimid. Nivåene AV EGFR og tubulin ble bestemt av western blotting. For celle-overflate fargeforsøk ble celler inkubert med primært ANTI-EGFR antistoff (Abcam, ab32077) på is i 40 min og vasket tre ganger med PBS. Alexa-Fluor 647-konjugerte sekundære antistoffer (Abcam, ab150083) ble deretter inkubert med cellene i 40 min på is og vasket tre ganger med PBS. Celler ble suspendert i 2% FBS i PBS og umiddelbart analysert via flowcytometri.

for Trefr-omsetningsforsøk ble cellene dyrket til 80% konfluens, vasket to ganger med PBS og sultet i SERUMFRITT DMEM i 2 timer ved 37 °C, deretter forbehandlet med 10-25 µ/ml cykloheksimid i 1 time i serumfritt DMEM, noe som forhindret syntese av ny TfR. Umiddelbart etter ble cellene kontinuerlig stimulert med 20 µ/ml Tf for 0, 30, 60, 120 eller 180 min i nærvær av cykloheksimid. Nivåene Av Sfr, IFITM3 og tubulin ble bestemt av western blotting.

sent endosom-og lysosomfusjonsanalyse

Celler ble inkubert i 4 timer i kulturmedium inneholdende 25 µ/ml pHrodo-rød dekstran, etterfulgt av en 20 timers jakt i fluoroforfritt medium for å fremme lysosomal akkumulering av dekstran. Cellene ble deretter inkubert i medium inneholdende 50 µ / ml dextran-Alexa Fluor 488 i 10 min ved 37 °C før erstatning med fluoroforfritt medium. På de nevnte tidspunktene ble cellene løst med iskald 4% PFA for immunfluorescensfarging.

lysosomale proteaseaktivitetsanalyser

Cathepsin B-aktivitet ble analysert ved bruk av cathepsin b-aktivitetssettet etter protokollen fra produsenten. Etter BEHANDLING MED IFN-α i 16 timer med Eller uten bafilomycin A1 ble Cellene inkubert Med Magic Red (1:26) i 30-60 minutter ved 37 °C før de ble vasket to ganger med PBS. Celler ble deretter løst ved hjelp av 4% PFA og analysert ved flowcytometri.

Aktivitetsbasert merking av cathepsiner (Vergent Bioscience, Pan Cathepsin probe) ble utført som tidligere rapportert med mindre modifikasjoner57. Kort sagt ble celler sådd 24 timer før merking, og celler ble aktivert MED IFN-α 16 timer før merking. Medier ble erstattet, og celler ble behandlet med 1 µ Iabp Pan Cathepsin-Sonde i 2 timer. Celler ble vasket MED PBS og lysert på is med en hypotonisk lysebuffer (50 mM RØR pH 7,4, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 4 mM DTT, 1% NP-40). Celleavfall ble fjernet ved å spinne ned lysater ved 500 × g i 5 min ved 4 °C. Supernatanter ble deretter blandet MED 4x prøvebelastningsbuffer, og 70 µ av totalt protein ble analysert AV SDS-PAGE. Gelen ble vasket to ganger med de-ionisert vann før in-gel fluorescens analyse På En Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Og Coomassie farging eller overføring for western blot analyse.

DiD-merking av virus

Renset influensavirus A/PR/8 / 34 (H1N1) OG rekombinant VSV som uttrykker LASV GPC (generert som tidligere beskrevet41) ble merket med selvslokkende konsentrasjoner av det lipofile fargestoffet 1,1 ‘- dioctactadecyl-3,3,3’, 3 ‘ – tetrametylindodikarbocyanin (DiD, Livsteknologier). Renset virus (1 mg/ml) i PBS ble inkubert med 50 µ Gjorde mens de ble omrørt i 1 t ved 4 °C. Viruset ble separert fra overflødig fargestoff ved hjelp av ultracentrifugering gjennom en 10% sukrosepute i 2 t ved 107 000 × g og 4 °C ved BRUK AV EN SW41-rotor (Beckman Coulter). Merkede viruspellets ble resuspendert i PBS med en virusproteinkonsentrasjon på 1 mg / ml, aliquotert og lagret ved -80 °C til bruk.

Stedsspesifikk merking AV IFITM3 i pattedyrceller

For studier av levende celler ble HeLa-celler sådd på 35 mm glassbunnskåler for å være på omtrent 70% konfluens for avbildning neste dag. Etter adherens ble cellene transfisert med et plasmid av interesse som inneholdt EN HA-IFITM3-TAG-variant (1 µ per tallerken) og Mm-PylRS-AF/Pyl-tRNACUA plasmid (1 µ per tallerken) ved bruk av 3 µ Viafect (Promega) i komplette cellevekstmedier som inneholdt unaturlige aminosyrer (TCOK). Etter inkubasjon over natten ble cellemedier endret til friske cellevekstmedier uten TCOK. Etter en annen 2-timers kultur ved 37 °C/5% CO2 ble cellene merket med tetrazin-fluoroforer (250 nM) I Fluorobrit DMEM (Life Technologies) i 30 minutter ved 37 °C og vasket med komplette cellevekstmedier tre ganger over 1 time.

Live cell imaging

for wide-field epifluorescence mikroskopi, celler ble transdusert Med CellLight vektorer (Life Technologies) for tidlig endosomer (RFP-Rab5), sent endosomer (RFP-Rab7), eller lysosomer (RFP-LAMP1) ca 18 h før avbildning i henhold til produsentens instruksjoner. Levende cellemikroskopi ble utført som tidligere beskrevet Med En AxioObserver.Z1 bredfelt epifluorescensmikroskop (Zeiss) utstyrt med et 40 × / 1.3 Na-mål, DAPI / GFP / Texas Red / Cy5 filtersett og oppvarmet miljøkabinett opprettholdt ved 37 °C. HeLa cellemonolag ble sådd på fibronektinbelagte 35 mm glassdekselfat (MatTek) 24 h før eksperimenter. Cellene ble avkjølt på is i flere minutter før spinokulering Av DiD-merket virus på monolag ved 1500 × g og 6 °C i 20 min. Ubundne partikler ble fjernet i fem vask med kalde PBS, og 500 µ kaldavbildningsbuffer (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM sukrose, 2 µ Hoechst 33342 og 2% FBS) ble tilsatt for å dekke cellene. Parabolen ble umiddelbart montert på mikroskopets mål og fokusert. Dekkskålen ble deretter oversvømmet med 1.5 ml varm bildebuffer for å markere starten på forsøkene (t = 0). Bilder ble kjøpt hver 10 s over varigheten av forsøkene ved hjelp Av en Enkelt Z-seksjon, som omfattet nesten alle celleassosierte partikler.

For konfokal mikroskopi Ble HeLa-celler sådd i 35 mm glassbunnskål (ibidi) og dyrket over natten. Neste dag ble cellene transfisert med et plasmid av interesse som inneholdt EN HA-IFITM3-TAG-variant (1 µ per tallerken) og Mm-PylRS-AF/Pyl-tRNACUA plasmid (1 µ per tallerken) ved bruk av 6 µ Lipofektamin 3000 i komplette cellevekstmedier som inneholdt TCOK. Etter 16 h inkubasjon ble cellemedier endret til friske cellevekstmedier uten TCOK. Etter en annen 6 h-kultur ved 37 °C / 5% CO2 ble cellene merket med tetrazin-BODIPY (500 nM) I FluoroBrite DMEM (Life Technologies)/10% FBS for 0.5 h ved 37 °C og vasket med FluoroBrite DMEM (Life Technologies)/10% FBS fire ganger over 2 h. til slutt ble cellene farget Med NucBlue Live Cell Stain (Life Technologies) i 20 min og avbildet I FluoroBrite DMEM/10% FBS med konfokal mikroskopi. For plasmamembranfarging ble celler farget Med CellMask Rød (1:1000, Life Technologies) I Live Cell Imaging Solution (LCIS) i 5 min ved 37 °C og vasket med LCIS tre ganger før farging med Nucblue Live Cell Stain. Cellene ble avbildet på et invertert lsm 780 laserskanning konfokalt mikroskop (Zeiss) med Et Zeiss Plan-Apokromatisk 63×/1.4 Na oljedypingsmål. Mikroskopet var utstyrt med en scene-top inkubator satt til 37 °C/5% CO2 for live-celle avbildning. Hoechst var begeistret med en 405 nm laser med utslippsspekter samlet mellom 410 nm og 480 nm. Tz-BODIPY var begeistret med en 488 nm laser med utslippsspekter samlet mellom 490 nm og 550 nm. CellMask Red var begeistret med en 561 nm laser med utslippsspekter samlet mellom 570 nm og 620 nm. Bildene ble kjøpt med ZEN blue 2012 software (Zeiss) og analysert Av ImageJ (NIH). Pearsons korrelasjonskoeffisienter ble beregnet I ImageJ ved Hjelp Av Coloc 2 plugin.

dataanalyse

bildeanalyse og single-partikkel sporing ble utført Ved Hjelp Av Volocity programvare (PerkinElmer) som tidligere beskrevet41. Bildefiler ble ikke manipulert, bortsett fra mindre justeringer i lysstyrke og kontrast. Viral puncta ble tersklet av innledende intensitet og størrelse. Puncta som falt utenfor området 0,25 til 1 µ2 forventet av individuelle DiD-merkede virioner ble ekskludert fra enkeltpartikkelanalyse. Virioner ble vurdert colocalized MED LAMP1 ELLER IFITM3 bare hvis cellemarkøren punctum oversteg bakgrunnssignalet med 30% eller mer, og HVIS GFP eller BODIPY Og gjorde puncta co-trafficked med større enn 70% overlapping av signaler. Gjennomsnittlige målinger ( ± s.d.) ble avledet fra tre separate eksperimenter, med mindre annet er angitt.

Analyse AV HA-IFITM3-TCOK uttrykksnivåer

for western blot analyse Ble HeLa-celler sådd i seks brønnplater og dyrket over natten. IFITM2/3-KO-celler ble transfisert MED HA-IFITM3-F8TAG (2,5 µ) Og Mm-PylRS-AF/Pyl-tRNACUA (2,5 µ) i NÆRVÆR AV TCOK (50 µ) i 16 timer. Hela WT-celler ble ubehandlet eller behandlet MED IFN-α (100 ng/ml) i 16 timer. nivåene AV IFITM3 ble bestemt ved western blotting ved bruk av anti-IFITM3 for kanin (1:1000; Proteintech gruppe, 11714-1-AP) og sekundært ANTISTOFF HRP-konjugert geit anti-kanin IgG (HCL; 111-035-003).

FOR immunfluorescensanalyse BLE IFITM2/3-KO-celler transfisert MED HA-IFITM3-F8TAG ([email protected]) Og Mm-PylRS-AF/Pyl-tRNACUA (1 µg) i NÆRVÆR AV TCOK (50 µ) i 16 timer. Hela WT-celler ble ubehandlet eller behandlet MED IFN-α (100 ng/ml) i 16 timer. Celler ble deretter festet med formaldehyd, permeabilisert med saponin (0,5%), og immunostisert med kanin anti-ifitm3 (1:100) (proteintech gruppe, 11714-1-AP) Og anti-kanin-alexa Fluor 647 KONJUGAT (1:1000) (Abcam, ab150083) for konfokal fluorescensavbildning. Hoescht (blå) brukes til å flekke kjerner. Cellene ble avbildet på et invertert lsm 780 laserskanning konfokalt mikroskop (Zeiss) med Et Zeiss Plan-Apokromatisk 63×/1,4 oljedypingsmål. Bildene ble tatt under identiske confocal mikroskop innstillinger.

FOR flowcytometrianalyse BLE IFITM2 / 3 KO-celler transfisert MED HA-IFITM3-F8TAG (1 ④g), Mm-PylRS-AF//pyl-tRNACUA (1 µ), i nærvær AV TCOK (50 µ) i 16 timer. Hela WT-celler ble behandlet MED ELLER uten IFN-α (100 ng/ml) i 16 timer. Cellene ble vasket to ganger med PBS og deretter festet med 400 µ AV PBS med 4% PFA i 10 min. De faste cellene ble permeabilisert med 200 µ av 0,2% saponin i PBS i 10 min og deretter blokkert med 200 µ 0,2% BSA og 0,2% saponin I PBS i 10 min. Celler ble behandlet med kaninanti-IFITM3 (1:300) (Proteintech group, 11714-1-AP) Og anti-kanin-Alexa Fluor 647 (1:1000) (Abcam, ab150083) I PBS med 0,02% saponin. Etter tre vask med PBS ble cellene resuspendert i 150 µ pbs med 0,2% BSA og 0,02% saponin. Prøvene ble analysert ved flowcytometri (BD LSRII). Dataanalyse ble utført ved Hjelp Av FLowJo programvare.

iav-infeksjon MED IFITM3 cys-mutanter

IFITM2 / 3 KO HeLa-celler ble sådd i 12 brønnplater (Corning) og dyrket over natten. Cellene ble transfisert samtidig MED HA-hIFITM3-konstruksjoner (1 µ / brønn) og Mm-PylRS-AF/Pyl-tRNA plasmid (1 µ/brønn) ved bruk av 3 µ Lipofektamin 3000 i 1 ml komplett cellevekstmedium inneholdende 10 µ av 100 mM BocK (endelig konsentrasjon 1 mM). Etter 16 timer ble celler infisert MED influensavirus A / PR / 8 / 34 virus (H1N1) MED MOI på 5. Etter 6 h infeksjon ble celler trypsinisert og samlet i klyngerør (Corning). Cellene ble vasket to ganger med PBS og deretter festet med 400 µ AV PBS med 4% PFA i 10 min. De faste cellene ble permeabilisert med 200 µ av 0,2% saponin i PBS i 10 min og deretter blokkert med 200 µ 0,2% BSA og 0,2% saponin I PBS i 10 min. Cellene ble behandlet med ANTI-influensa NP antistoff konjugert Til AlexaFluor-647 og anti-HA antistoff konjugert Til Alexa-fluor-594 (1:250) I PBS med 0,02% saponin. Etter tre vask med PBS ble cellene resuspendert i 150 µ pbs med 0,2% BSA og 0.02% saponin. Prøvene ble analysert ved flowcytometri (BD LSRII). Alle prøver ble først inngjerdet VED HA-positiv farging, noe som indikerer vellykket transfeksjon, og DERETTER np-positiv prosentandel AV np-positiv farging, noe som indikerer vellykket infeksjon. Ha-tag-epitopen er avledet Fra En H3 influensavirusstamme og er ikke tilstede I PR8-stammen AV h1n1 influensavirus. Dataanalyse ble utført ved Hjelp Av FLowJo programvare.

s-palmitoylation assays

Metabolsk merking av celler med alkyn-palmitinsyre reporter alk-16 ble utført som tidligere beskrevet58 med noen modifikasjoner. Alk-16 og az-rho ble syntetisert som tidligere rapportert58. IFITM2 / 3 KO HeLa-celler ble transfisert MED HA-hIFITM3-konstruksjoner som beskrevet ovenfor. Etter 16 timer ble celler inkubert med 50 µ alk-16 i DMEM inneholdende 10% FBS for 2 timer. Celler ble høstet, vasket en gang med PBS og lysert i 1% Brij 97 (Sigma) i 50 mM TE, 150 mM NaCl pH 7,4, 1x Roche proteasehemmer og 1500 enheter/ml benzonase (EMD). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bca-analysen. For immunoprecipitation, 150 µg av total protein ble lagt til 20 µl anti-HA antistoff-conjugated agarose (Sigma) i et samlet volum på 150 µl og rystet ved 4 °C for 1 h. Agarose perler ble vasket av resuspension i 500 µl 50 mM HEPES-buffer (som inneholder 150 mM NaCl, pH 7.4) ved sentrifugering på 3,500 × g i 30 s. Perlene så ble resuspendert i 45 µl av de ovennevnte buffer og 5 µl av CuAAC reaktant løsning (0.5 µl 10 mM azido-rhodamine (endelig konsentrasjon på 100 µM), 1 µl 50 mM nylaget CuSO4·5H2O i H2O (endelig konsentrasjon på 1 mM, Sigma), 1 µl 50 mM nylaget TCEP (endelig konsentrasjon på 1 mM) og 2,5 ĩl av 10 mM Trisamine (TBTA) (endelig konsentrasjon 500 µM)) ble lagt. Prøvene ble rocket ved romtemperatur i 1 h og vasket to ganger med RIPA buffer. Laemmli prøvebuffer (20 µ) ble tilsatt til prøvene (1,0: 1,3 forhold mellom buffer til prøve), som ble oppvarmet i 10 minutter ved 95 °C og separert med gelelektroforese. In-gel fluorescens skanning ble utført ved Hjelp Av En Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System. Western blots FOR HA-merkede proteiner ble utført ved bruk av ET ANTI-HA HRP-konjugert antistoff (1:1000; Roche). Kvantifisering av båndintensiteter i fluorescensgeler og western blots ble utført med Image Lab (Bio-Rad). Data fra tre biologiske replikater ble kvantifisert og i gjennomsnitt for plotting.

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.

Posted on

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.