Igg1とIgg3のFcyRの結合と活性化

Igg1はヒト血清中で優勢であり、形質細胞癌(多発性骨髄腫)患者の血清から単離されたモノクローナルタンパク質として容易に入手可能であるため、初期の構造および機能研究はこのIgGサブクラスに焦点を当てた。 これは、Igg1は、IgG-Fc媒介リガンド結合およびエフェクター活性化機能のすべてを定義したことを蒸散しました。 比較研究は、Igg3が同等の機能的活性を媒介する一方で、Igg2およびIgg4が1つまたは複数の活性において制限を示すことを示した。 IgG定常領域遺伝子は多型であり、これはIgG遺伝子ハプロタイプの遺伝およびIgG-Fcタンパク質配列の結果としての違いに反映される。IgG-Fc多型が構造および機能に及ぼす影響に対処した研究はほとんどありませんが、Igg3はSpAに結合する能力が異なる異型型を有する非常に広範な多型を示しています。対照的に、いくつかの研究は、感染性薬剤に対する臨床応答に対するIgG多型の影響の可能性に焦点を当てている。33,34

Fc Γ Riの結合および活性化のための変異Igg1-Fcの最初のスキャンに続いて、17,18Shields et al.抗IgE抗体の全長キメラIgg1、Igg2、Igg3、およびIgg4変異体を用いた包括的な研究を発表した。 Igg1アイソタイプのすべての溶媒露出残基は、順次アラニンによって置換された。 IgGタンパク質とFc Γ RとFcRnのhisタグ付き細胞外ドメインは、非定型Fc Γ Riiiaグリコフォームを生成することが示されているHEK293細胞で発現した。 Iggタンパク質産物を、ElisaアッセイにおけるFc Γ RおよびFcrnのサブタイプへのそれらの結合に従って分類した:クラス1は、全てのFc Γ Rへの結合の減少を示した;ク 有意に、−L2 3 4−L−G−G2 3 7−配列を包含する下部ヒンジ領域の残基は、試験した全てのFc Γ Rサブタイプへの結合に影響を及ぼすが、Fcrnへの結合には影響しな これらのデータは、−L2 3 4−L−G−G2 3 7−配列がDeisenhofer Igg−Fc構造に定義された立体配座をもたらさず、可動性であると仮定されたため、当時は直感に反していた18。; この難問は、下部ヒンジ領域にある結合を示し、複合体内で定義された構造を仮定した-L234-L–G–G237–配列を包含するFc Γ Riiibのアグリコシル化形と複合体中のIgg1–Fcのためのx線結晶構造の出版物で解決されました。無傷のIgg分子のヒンジ領域内の柔軟性により、各Fab領域は、個別に個々のFc Γ Rへの結合に対応し得るIgg−Fc立体配座の平衡の生成と、その特異的抗原と係合す Igg−Fc立体配座およびFc Γ R認識の微妙さは、C H3ドメイン内の特定の残基の置換がFc Γ r結合親和性にも影響を及ぼすという発見によって強調される。 その後の出版物では、Shields et al.Fc Γ Riiiaに対するIgg−Fcの非フコシル化グリコフォームの結合親和性の5 0倍の増加およびNK細胞媒介ADCCの結果としての増加を実証した。 これらの画期的な出版物に続く十年では、研究は、in vivoでの所与の疾患適応症に最適である可能性があり、エフェクター機能プロファイルを持つ抗体治療法を生成することを目的として、差動的に最大化または最小化の結合と選択されたFc Γ RとFcRnの活性化に向けられています。 特定の目標は、活性化および阻害性Fc Γ Rとの相互作用を差動的に上方または下方調節することであった。

リツキシマブの作用機序の初期評価は、NK細胞上で発現されたFc Γ Riiiaの関与を介して媒介されるADCCを示した。 この結論は、非ホジキンリンパ腫における疾患寛解が、Igg1−Fcに対するそれらの親和性が異なるFc Γ Riiia受容体の多型変異体に関連しているという知見によ対立遺伝子産物は、細胞外ドメインの158位(Fc Γ Riiia-V158およびFc Γ Riiia-F158)におけるバリン(V)またはフェニルアラニン(F)の存在において異なる。 これらの残基は、後に、Igg−Fc/Fc Γ Riii相互作用部位内に位置することが示された。36,37その結果、研究は、患者のFc Γ Riiiaハプロタイプに関係なく、ADCCの結果的な増加を期待して、各Fc Γ Riiia対立遺伝子の産物に対する結合親和性の増加をもたらすIgG-Fc変異を有する抗体を生成することに向けられている。 Afucosylated Igg1-Fcのための高められた類縁のより早いデモンストレーションは非fucosylated抗体を発生させる安定した生産の細胞ラインの開発と強化されました。38,41,42これらの抗体についてin vitroで実証された癌細胞を殺すための改善された有効性は、タンパク質工学を通じてFc Γ Riiiaを介したADCCを改善しようとする 知的な挑戦に加えて、成功はbiobetterの治療薬の生成のために利用されるかもしれない重要な知的財産(IP)および特許取得のための機会を発生させること

計算設計アルゴリズムとハイスループットスクリーニングを使用して、XencorはFcyR結合と生物学的活性の変化したプロファイルを示すIgG-Fc変異体の広範なパ「コア」変異は、残基S2 3 9D/I3 3 2Eの交換であるように見え、Fc Γ Riiiaの多型の両方に対して約4 0倍の親和性の増加、およびFc Γ RiiaおよびFc Γ Riibについて約1 0倍の増加を示したIgg−Fc44S239D/I332E変異を有する抗CD40抗体は、野生型Igg1タンパク質と比較して、白血病細胞のADCCの〜150倍の増加を示した。; 対照的に、二重変異体G236R/L328R.44についてFc Γ R結合が廃止され、配列N297D/A330Y/I332Eを有するIgG-Fcのアグリコシル化形態の生成がFc Γ Riiiaに対して-43%の結合親和性を回復したことがさらに示された。45,46課題は、活性化Fc Γ Riia受容体に対する親和性の増加が、阻害性Fc Γ Riib受容体に対する親和性の低下を生成するために残った。 S239D/I332E/G236変異体は、このプロパティを示した;46G236A変異単独で-70倍大きいFc Γ Riia親和性を配信し、マクロファージによって強化されたADCPを媒介した。興味深いことに、この変異体は、Fc Γ Ri結合および活性化の減少または失われた以前の報告とは対照的に、Fc Γ Ri結合に対する影響が最小限であることが示された。48,49残基2 9 6〜3 0 0に注目し、N2 9 7/S2 9 8G/T2 9 9A変異Iggが、HEK2 9 3細胞中で産生されたときにアグリコシル化されたが、野生型Igg−Fcに匹敵するFc Γ RiiaおよびFc Γ Riibに対す Fc Γ Riiiaに対する親和性が増加した変異体は、酵母ディスプレイ技術を介して機能的な遺伝的スクリーンを用いたマクロ遺伝学によって生成された。 IgGタンパク質のシリーズは、Fc Γ r認識の個々のプロファイルを示したCH2とCH3ドメインの両方で置換で単離された。 Fc Γ Riiiaへの結合を増強したが、阻害性Fc Γ Riib受容体への結合を減少させた5つの置換(L2 3 5V、F2 4 3L、R2 9 2P、Y3 0 0L P3 9 6L)を有するFcを有する抗HER2抗体を開発した。 この構築物は、野生型タンパク質と比較して〜100倍の溶解速度の増加を示す、HER2発現癌細胞の強化された殺傷を示した。51,52

アグリコシル化IgG-Fcの包括的なパネルは、代替アミノ酸のそれぞれによるアスパラギン297の置換によって生成されました。 N2 9 7y変異体は、遺伝子部位飽和突然変異誘発(GSSM)のために選択され、Fc Γ R、Fcrn、およびC1Qへの結合および食作用を促進するそれらの能力についてスクリー予想されるように、変異体の大部分は、より低い結合活性を示したか、または結合活性を示さなかった。; しかし、Fc Γ Riiiaへの結合が3 2倍、1 5倍、および1 1倍増加する変異体は、変異体N2 9 7Y/Ser2 5 4W、N2 9 7YQ4 1 8W、およびN2 9 7Y/V2 5 9Yについてそれぞれ報告された。 多くの変異体は、野生型と同様のFc Γ Riに対する結合活性を有し、または野生型と比較して増加し、および/またはFcrnに対する結合を増加させた;対照的に、Fc Γ Riiaへの結合は、各変異体について実質的に廃止された。 驚くべきことに、N2 9 7a変異体は、Fc Γ Riに対する結合の喪失の以前の報告とは対照的に、野生型に近い活性を有することが報告された。54

Jung et al.Fc Γ Rに結合するIgG-Fc変異体の組合せライブラリーをスクリーニングするための発現を使用して、大腸菌がグリコシル化を行うことができないことを利 彼らは、グリコシル化Igg1抗体とほぼ同一の親和性でFc Γ Riへの結合を付与したC H3領域内の二重変異体E3 8 2V/M4 2 8Iを特徴とした。他の全てのFc Γ Rへの結合がアブレーションされた;興味深いことに、HEK2 9 3細胞で産生されたときに、この抗体変異体のグリコシル化形態について、全てのFc Γ Rへの結合が観察された。 抗HER2抗体トラスツズマブに導入され、e.coli中で産生されたとき、生成物は、野生型グリコシル化トラスツズマブとは対照的に、樹状細胞媒介ADCCを影響した。しかし、E382V/M428I残基は、CH2–CH3界面での接触残基であり、おそらく、この相互作用の摂動は、距離での立体配座に影響を与えることができます。

エラーが発生しやすいリボソームディスプレイを用いて、Fc Γ Riiiaへの結合の強化についてスクリーニングされたIgG-Fc変異体のパネルを生成しました。F2 4 3L/T3 9 3A/H4 3 3P変異体は、Fc Γ Riiiaに対する結合親和性を増加させ、約4倍の増強されたADCCを媒介することが示された。 証拠は、F243L変異が強化された活性のために主に責任があったことを示唆するために提示された;しかし、改善された機能は、フコースを欠いているが、二分N-アセチルグルコサミンを発現するグリコフォームのレベルの観察された増加とより密接に相関する可能性があります。 以前の研究は、CHO細胞で産生されるF243A変異体は、フコシル化され、Fc Γ Ri結合の有意な減少とガラクトシル化とシアリル化の高レベルを示したことを報58

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