IgG1 a IgG3 vazba a aktivace FcyR

protože IgG1 převažuje v lidském séru a je snadno dostupný jako monoklonální protein izolovaný ze séra pacientů s karcinomem plazmatických buněk (mnohočetný myelom), byly na tuto podtřídu IgG zaměřeny rané strukturální a funkční studie. Ukázalo se, že IgG1 definoval všechny funkce vazby ligandu a aktivace efektoru zprostředkované IgG-Fc. Srovnávací studie prokázaly, že IgG3 zprostředkovává srovnatelnou funkční aktivitu, zatímco IgG2 a IgG4 vykazují omezení v jedné nebo více aktivitách. Geny konstantní oblasti IgG jsou polymorfní,což se odráží v dědičnosti haplotypů genu IgG a následných rozdílech v proteinových sekvencích IgG-Fc.29 několik studií se zabývalo dopadem polymorfismů IgG-Fc na strukturu a funkci; IgG3 však vykazuje velmi rozsáhlý polymorfismus s allotypickými formami, které se liší svou schopností vázat SpA.32 naproti tomu některé studie se zaměřily na možné vlivy IgG polymorfismů na klinické odpovědi na infekční agens.33,34

po počátečním skenování mutantu IgG1-Fc pro vazbu a aktivaci FcyRI,17, 18 Shields et al.35 publikoval komplexní studii, která používala celovečerní chimérické IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4 varianty anti-IgE protilátky. Všechna rezidua izotypu IgG1 vystavená rozpouštědlem byla postupně nahrazena alaninem. IgG proteiny a His-značené extracelulární domény FcyR a FcRn byly exprimovány v buňkách HEK293, nyní se ukázalo, že generují atypické Glykoformy FcyRIIIa. Proteinové produkty IgG byly klasifikovány podle jejich vazby na podtypy FcyR a FcRn v testu ELISA: Třída 1 vykazovala sníženou vazbu na všechny FcyRs; Třída 2, snížená vazba na FcyRII a FcyRIIIa; Třída 3, zlepšená vazba na FcyRII a FcyRIIIa; atd. Významně se ukázalo, že rezidua v oblasti dolního závěsu, zahrnující sekvenci-L234-L-G-G237, ovlivňují vazbu na všechny testované podtypy FcyR, ale ne FcRn. Tato data byla v té době neintuitivní, protože sekvence-L234-L-G-G237 nepřinesla definovanou konformaci ve struktuře Deisenhofer IgG-Fc18 a předpokládalo se, že je mobilní; tento hlavolam byl vyřešen zveřejněním rentgenové krystalové struktury pro IgG1-Fc v komplexu s aglykosylovanou formou FcyRIIIb, která vykazovala vazbu v oblasti spodního závěsu a zahrnující sekvenci-L234-L-G-G237, která předpokládala definovanou strukturu uvnitř komplexu.37,38 flexibilita v oblasti závěsu intaktní molekuly IgG umožňuje každé oblasti Fab zapojit svůj specifický antigen do generování rovnováhy konformerů IgG-Fc, které mohou samostatně pojmout vazbu na individuální FcyR. Jemnost konformace IgG-Fc a rozpoznávání FcyR je zdůrazněna zjištěním, že substituce určitých reziduí v doméně CH3 také ovlivnila vazebnou afinitu FcyR. V následující publikaci Shields et al.38 prokázalo 50násobné zvýšení vazebné afinity nefukosylované glykoformy IgG-Fc pro FcyRIIIa a následné zvýšení ADCC zprostředkovaného NK buňkami. V desetiletí následujícím po těchto významných publikacích, výzkum byl zaměřen na diferenciální maximalizaci nebo minimalizaci vazby a aktivace vybraných FcyR a FcRn, s cílem generovat protilátková terapeutika s profilem efektorové funkce, který by mohl být optimální pro danou indikaci onemocnění in vivo. Zvláštním cílem bylo diferencovaně zvýšit nebo snížit interakci s aktivačním a inhibičním FcyR.

počáteční hodnocení mechanismu účinku rituximabu indikovalo ADCC, zprostředkované interakcí FcyRIIIa exprimované NA NK buňkách. Tento závěr byl podpořen zjištěním, že remise onemocnění u non-Hodgkinova lymfomu byla spojena s polymorfními variantami receptoru FcyRIIIa, které se liší svou afinitou k IgG1-Fc.39,40 alelické produkty se liší v přítomnosti valinu (V) nebo fenylalaninu (F) v poloze 158 (FcyRIIIa-V158 a FcyRIIIa-F158) v extracelulární doméně. Později se ukázalo, že tato rezidua se nacházejí v místě interakce IgG-Fc / FcyRIII.36,37 v důsledku toho byl výzkum zaměřen na generování protilátek s mutacemi IgG-Fc, které vedou ke zvýšené vazebné afinitě k produktům každé alely FcyRIIIa, s očekáváním následného zvýšení ADCC bez ohledu na haplotyp FcyRIIIa pacienta. Dřívější prokázání zvýšené afinity k afukosylovanému IgG1-Fc bylo konsolidováno s vývojem stabilních produkčních buněčných linií generujících nefukosylované protilátky.38,41,42 zlepšená účinnost zabíjení rakovinných buněk prokázaná in vitro pro tyto protilátky povzbudila další výzkumné skupiny a společnosti, aby se pokusily zlepšit ADCC zprostředkovanou Fcyriiií prostřednictvím proteinového inženýrství. Kromě intelektuální výzvy by úspěch mohl přinést významné duševní vlastnictví (IP) a příležitosti pro získání patentů, které by mohly být využity pro generování biobetterových terapeutik.

pomocí výpočetních návrhových algoritmů a vysoce výkonného screeningu vytvořil Xencor rozsáhlý panel IgG-Fc mutantů vykazujících změněné profily vazby FcyR a biologických aktivit.43-46″ jádrovou “ mutací se jevila výměna reziduí S239D / I332E za vzniku IgG-Fc, který vykazoval ~40-násobnou zvýšenou afinitu pro obě polymorfní formy FcyRIIIa a ~10-násobné zvýšení pro FcyRIIa a FcyRIIb.44 protilátka proti CD40 nesoucí mutaci s239d / I332E vykazovala ~150násobné zvýšení ADCC pro leukemické buňky ve srovnání s proteinem IgG1 divokého typu; naproti tomu vazba FcyR byla zrušena pro dvojitý mutant G236R / L328R. 44 dále bylo prokázáno, že generace aglykosylované formy IgG-Fc mající sekvenci N297D/A330Y/I332E obnovila ~43% vazebnou afinitu pro FcyRIIIa.45,46 zůstala výzva ke zvýšení afinity k aktivačnímu receptoru FcyRIIa, ale nižší afinita k inhibičnímu receptoru Fcyriibu. Mutant S239D / I332E / G236 vykazoval tuto vlastnost; 46 samotná mutace G236A dodala ~70krát větší afinitu FcyRIIa a zprostředkovala zvýšenou ADCP makrofágy.47 je zajímavé, že bylo prokázáno, že tento mutant má minimální vliv na vazbu FcyRI, na rozdíl od předchozích zpráv o snížené nebo ztracené vazbě a aktivaci FcyRI.48,49 Sazinsky et al.50 zaměřila pozornost na rezidua 296 až 300 a ukázala, že mutantní IgG N297/S298G/T299A byl aglykosylován, když byl produkován v buňkách HEK293, přesto vykazoval afinitu k Fcyriii a Fcyriibu srovnatelnou s IgG-Fc divokého typu. Mutanty se zvýšenou afinitou k Fcyriiii byly generovány Makrogeniky využívajícími funkční genetickou obrazovku pomocí technologie zobrazení kvasinek. Byla izolována řada IgG proteinů se substitucemi v doménách CH2 i CH3, které vykazovaly jednotlivé profily rozpoznávání FcyR. Byla vyvinuta protilátka anti-HER2 nesoucí Fc s pěti substitucemi (L235V, F243L, R292P, Y300L P396L), která vykazovala zvýšenou vazbu na FcyRIIIa, ale sníženou vazbu na inhibiční receptor Fcyriibu. Tento konstrukt vykazoval zvýšené zabíjení rakovinných buněk exprimujících HER2, vykazující ~100násobně zvýšenou rychlost lýzy ve srovnání s proteinem divokého typu.51,52

komplexní panel aglykosylovaného IgG-Fc byl vytvořen substitucí asparaginu 297 každou z alternativních aminokyselin. Mutant N297Y byl vybrán pro saturaci genového místa Mutagenesis™ (GSSM™) s generací dalších 222 mutantů, kteří byli vyšetřeni na vazbu na FcyR, FcRn a C1q a na jejich schopnost podporovat fagocytózu.53 jak se očekávalo, většina mutantů vykazovala nižší nebo žádnou vazebnou aktivitu; u variant N297Y/Ser254W, N297YQ418W a N297Y/V259y však byly hlášeny mutanty s 32-, 15-a 11-násobným zvýšením vazby na FcyRIIIa. Mnoho mutantů mělo vazebnou aktivitu pro FcyRI podobnou nebo zvýšenou ve vztahu k divokému typu a / nebo zvýšenou vazbu na FcRn; naproti tomu vazba na Fcyriii byla prakticky zrušena pro každého z mutantů. Překvapivě bylo hlášeno, že mutant N297A má téměř divokou aktivitu, na rozdíl od předchozích zpráv o ztrátě vazby na FcyRI.54

Jung et al.55 využil neschopnosti Escherichia coli provést glykosylaci pomocí exprese k screeningu kombinatorické knihovny IgG-Fc mutantů vázajících se na FcyR. Charakterizovali dvojitý mutant, E382V / M428I, v oblasti CH3, který udělil vazbu na FcyRI s afinitou téměř identickou s afinitou glykosylovaných IgG1 protilátek.55,56 vazba na všechny ostatní FcyRs byla ablována; zajímavé je, že vazba na všechny FcyRs byla pozorována pro glykosylovanou formu tohoto mutantu protilátky, když byla produkována v buňkách HEK293. Po zavedení do anti-HER2 protilátky trastuzumabu a produkované v E. coli, produkt provedl ADCC zprostředkovaný dendritickými buňkami, na rozdíl od glykosylovaného trastuzumabu divokého typu.55,56 je pozoruhodné, že tyto substituce v doméně CH3 by měly mít tak hluboký vliv na vazbu FcyR v místě spodního závěsu; zbytky E382V/M428I jsou však kontaktními zbytky na rozhraní CH2-CH3 a pravděpodobně porucha této interakce může ovlivnit konformaci na dálku.

zobrazení ribozomu náchylné k chybám bylo použito ke generování panelů IgG-Fc mutantů, které byly testovány na zvýšenou vazbu na FcyRIIIa.57 mutant F243L / T393A / H433P měl zvýšenou vazebnou afinitu k Fcyriiii a bylo prokázáno, že zprostředkovává ~čtyřnásobně zvýšený ADCC. Byly předloženy důkazy, které naznačují, že mutace F243L byla většinou odpovědná za zvýšenou aktivitu; zlepšená funkce však může těsněji korelovat s pozorovaným zvýšením hladin glykoform bez fukosy, ale exprimující půlení N-acetylglukosaminu. Dřívější studie uváděly, že mutant F243A, produkovaný v buňkách CHO, byl fukosylován a vykazoval vysoké hladiny galaktosylované a sialylace s významným snížením vazby FcyRI.58

Posted on

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.