IgG1 és IgG3 kötődés és az FcyR aktiválása

mivel az IgG1 túlsúlyban van a humán szérumban, és plazmasejtes rákos betegek szérumából izolált monoklonális fehérjeként (myeloma multiplex) könnyen elérhető, a korai strukturális és funkcionális vizsgálatok erre az IgG alosztályra összpontosítottak. Kiderült, hogy az IgG1 meghatározta az IgG-Fc által közvetített ligandumkötési és effektor aktivációs funkciókat. Összehasonlító vizsgálatok kimutatták, hogy az IgG3 hasonló funkcionális aktivitást közvetít, míg az IgG2 és az IgG4 egy vagy több aktivitásban korlátokat mutat. Az IgG állandó régió génjei polimorfak, és ez tükröződik az IgG gén haplotípusainak öröklődésében és az ebből eredő különbségekben az IgG-Fc fehérje szekvenciákban.29 kevés tanulmány foglalkozott az IgG-Fc polimorfizmusok szerkezetére és működésére gyakorolt hatásával; az IgG3 azonban nagyon kiterjedt polimorfizmust mutat, allotípusos formákkal, amelyek különböznek a SpA megkötési képességében.32 ezzel szemben néhány tanulmány az IgG polimorfizmusainak a fertőző ágensekre adott klinikai válaszokra gyakorolt lehetséges hatásaira összpontosított.33,34

a mutáns IgG1-Fc kezdeti letapogatását követően az Fcyri kötődése és aktiválása céljából 17,18 pajzs et al.35 publikált egy átfogó tanulmányt, amely egy anti-IgE antitest teljes hosszúságú kiméra IgG1, IgG2, IgG3 és IgG4 variánsait alkalmazta. Az IgG1 izotípus összes oldószernek kitett maradékát egymás után alaninnal helyettesítettük. Az IgG fehérjék és az Fcyr és az FcRn hek293 sejtekben expresszált extracelluláris doménjei atipikus fcyriiia glikoformákat generálnak. Az IgG fehérjetermékeket az FcyR és az FcRn altípusokhoz való kötődésük szerint osztályozták egy ELISA vizsgálatban: az 1.osztály csökkentette az összes Fcyr-hez való kötődést; a 2. osztály csökkentette az FcyRII-hez és az FcyRIIIa-hoz való kötődést; a 3. osztály javította az FcyRII-hez és az FcyRIIIa-hoz való kötődést; stb. Szignifikánsan kimutatták, hogy a –L234–L–G–G237– szekvenciát felölelő alsó csuklóterület maradékai befolyásolják az összes vizsgált FcyR altípushoz való kötődést, de az FcRn-t nem. Ezek az adatok ellentmondásosak voltak abban az időben, mivel az –L234-L-G-G237-szekvencia nem adott meghatározott konformációt a Deisenhofer IgG-Fc szerkezetben18, és feltételezték, hogy mobil; ezt a rejtélyt az IgG1-Fc röntgenkristályszerkezetének közzétételével oldottuk meg komplexben egy aglikozilezett FcyRIIIb formával, amely kötődést mutatott az alsó csuklórégióban, és átfogta az-L234 –L–G–G237–szekvenciát, amely a komplexen belül meghatározott struktúrát feltételezett.37,38 az intakt IgG molekula zsanértartományán belüli rugalmasság lehetővé teszi, hogy minden egyes Fab régió összekapcsolja specifikus antigénjét az IgG-Fc konformerek egyensúlyának létrehozásával, amely külön-külön befogadhatja az egyes FcyR-hez való kötődést. Az IgG-Fc konformáció és az FcyR felismerés finomságát hangsúlyozza az a megállapítás, hogy bizonyos szermaradékok helyettesítése a CH3 doménen belül szintén befolyásolta az FcyR kötési affinitását. Egy későbbi kiadványban, Shields et al.38 az IgG-Fc nem fukozilezett glikoformjának az FcyRIIIa-hoz való kötődési affinitása 50-szeresére nőtt, és ennek következtében az NK-sejt által közvetített ADCC is növekedett. Az ezeket a mérföldkőnek számító publikációkat követő évtizedben a kutatás a kiválasztott FcyR és FcRn kötődésének és aktiválásának differenciális maximalizálására vagy minimalizálására irányult, azzal a céllal, hogy antitest terápiákat állítsanak elő olyan effektor funkcióprofillal, amely optimális lehet egy adott betegség indikációjára in vivo. Egy különleges cél az volt, hogy differenciálisan fel – vagy downregulate kölcsönhatás aktiváló és gátló FcyR.

a rituximab hatásmechanizmusának kezdeti értékelése ADCC-t jelzett, amelyet az NK sejteken expresszált FcyRIIIa kapcsolódása közvetített. Ezt a következtetést támasztotta alá az a megállapítás, hogy a betegség remissziója a non-Hodgkin limfómában az FcyRIIIa receptor polimorf variánsaihoz kapcsolódik, amelyek különböznek az IgG1-Fc iránti affinitásukban.39,40 az alléltermékek különböznek a valin (V) vagy fenilalanin (F) jelenlétében a 158.pozícióban (FcyRIIIa-V158 és FcyRIIIa-F158) az extracelluláris doménben. Később kimutatták, hogy ezek a maradékok az IgG-Fc/FcyRIII kölcsönhatás helyén találhatók.36,37 következésképpen a kutatás IgG-Fc mutációkkal rendelkező antitestek előállítására irányult, amelyek fokozott kötődési affinitást eredményeznek az egyes FcyRIIIa allélok termékeihez, azzal a várakozással, hogy az ADCC ennek következtében növekszik, függetlenül a beteg FcyRIIIa haplotípusától. Az afukozilezett IgG1-Fc iránti megnövekedett affinitás korábbi demonstrációját konszolidáltuk a nem fukozilezett antitesteket generáló stabil termelési sejtvonalak kialakulásával.38,41,42 ezeknek az antitesteknek az in vitro kimutatott, a rákos sejtek elpusztításában mutatott jobb hatásossága arra ösztönözte más kutatócsoportokat és vállalatokat, hogy megkíséreljék javítani az FcyRIIIa által közvetített ADCC-t fehérjetechnikával. A szellemi kihívás mellett a siker jelentős szellemi tulajdonhoz (IP) és szabadalomszerzési lehetőségekhez vezethet, amelyeket ki lehet használni a biobetter terápiák előállításához.

számítógépes tervezési algoritmusok és nagy áteresztőképességű szűrés segítségével a Xencor kiterjedt IgG-Fc mutánsokat hozott létre, amelyek az FcyR kötődés és a biológiai aktivitás megváltozott profilját mutatják.43-46 úgy tűnt, hogy egy “mag” mutáció az S239D/I332E maradékok cseréje, amely olyan IgG-Fc-t eredményez, amely ~40-szer nagyobb affinitást mutatott az FcyRIIIa polimorf formái iránt, és ~10-szeres növekedést mutatott az FcyRIIa és az FcyRIIb esetében.44 Az S239D/I332E mutációt hordozó anti-CD40 antitest a leukémiás sejtek ADCC-jének ~150-szeres növekedését mutatta a vad típusú IgG1 fehérjéhez képest; ezzel szemben az FcyR-kötést hatályon kívül helyezték a kettős mutáns G236R/L328R.44 azt is kimutatták, hogy az N297D/A330Y/I332E szekvenciával rendelkező IgG-Fc aglikozilezett formájának előállítása ~43% – os kötési affinitást mutatott az FcyRIIIa iránt.45,46 továbbra is kihívást jelentett az aktiváló FcyRIIa receptor iránti megnövekedett affinitás, de a gátló FcyRIIb receptor iránti alacsonyabb affinitás. Az S239D/I332E / G236 mutáns mutatta ezt a tulajdonságot;46 a G236A mutáció önmagában ~70-szer nagyobb FcyRIIa affinitást adott, és fokozott ADCP-t közvetített makrofágok által.47 érdekes módon ennek a mutánsnak minimális hatása volt az FcyRI kötődésre, szemben a korábbi, csökkent vagy elveszett FcyRI kötődésről és aktiválódásról szóló jelentésekkel.48,49 Sazinsky et al.50 a 296-300 szermaradékokra összpontosította a figyelmet, és kimutatta, hogy az N297/S298G/T299A mutáns IgG aglikozilált volt, amikor hek293 sejtekben termelődött, ugyanakkor az FcyRIIa és az FcyRIIb rokonsága hasonló volt a vad típusú IgG-Fc-hez. Az FcyRIIIa iránti fokozott affinitású mutánsokat Makrogenika generálta funkcionális genetikai képernyő élesztő megjelenítési technológián keresztül. IgG fehérjék sorozatát izoláltuk szubsztitúciókkal mind a CH2, mind a CH3 doménekben, amelyek egyedi fcyr-felismerési profilokat mutattak. Egy anti-HER2 antitestet fejlesztettek ki, amely Fc-t hordoz öt szubsztitúcióval (L235V, F243L, R292P, Y300L P396L), amelyek fokozott kötődést mutattak az FcyRIIIa-hoz, de csökkent kötődést mutattak a gátló FcyRIIb receptorhoz. Ez a konstrukció a HER2-expresszáló rákos sejtek fokozott elpusztítását mutatta, ~100-szor nagyobb lízis arányt mutatva a vad típusú fehérjéhez képest.51,52

aglikozilált IgG-Fc-t tartalmazó átfogó panelt hoztunk létre az aszparagin 297 helyettesítésével az egyes alternatív aminosavakkal. Az N297Y mutánst kiválasztottuk a génhely-szaturációs mutagenezis (gssm) szempontjából, 222 további mutáns generálásával, amelyeket szűrtünk az FcyR-hez, az FcRn-hez és a C1q-hoz való kötődés, valamint a fagocitózis elősegítésére való képesség szempontjából.53 ahogy az várható volt, a mutánsok többsége alacsonyabb vagy egyáltalán nem mutatott kötő aktivitást; az FcyRIIIa-hoz való kötődés 32-szeres, 15-szeres és 11-szeres növekedését mutató mutánsokról azonban az N297Y/Ser254W, az N297YQ418W és az N297Y/V259Y variánsok esetében számoltak be. Sok mutáns kötő aktivitása az fcyri-hez hasonló volt, vagy a vad típushoz képest megnövekedett, és / vagy fokozta az fcrn-hez való kötődést; ezzel szemben az FcyRIIa-hoz való kötődést gyakorlatilag megszüntették minden mutáns esetében. Meglepő módon az N297A mutánsról azt jelentették, hogy közel vad típusú aktivitással rendelkezik, ellentétben az fcyri kötődésének elvesztéséről szóló korábbi jelentésekkel.54

Jung et al.55 kihasználta az Escherichia coli képtelenségét glikozilezés expresszióval az FcyR-hez kötődő IgG-Fc mutánsok kombinatorikus könyvtárának szűrésére. Jellemezték a kettős mutánst, az E382V / M428I-t a CH3 régióban, amely az FcyRI-hez való kötődést a glikozilezett IgG1 antitestekkel közel azonos affinitással biztosította.55,56 az összes többi Fcyrhez való kötődést abláltuk; érdekes módon az összes fcyrhez való kötődést megfigyeltük ezen antitest mutáns glikozilezett formájához, amikor hek293 sejtekben termelődtek. A trasztuzumab anti-HER2 antitestbe történő bejuttatásakor és E. coli-ban történő előállításakor a termék dendritikus sejt-mediált ADCC-t váltott ki, szemben a vad típusú glikozilált trasztuzumabbal.55,56 figyelemre méltó, hogy ezeknek a CH3 doménen belüli szubsztitúcióknak ilyen mély hatást kell gyakorolniuk az fcyr kötődésére az alsó csuklóhelyen; az E382V/M428I maradványok azonban a CH2–CH3 határfelületen lévő kontakt maradékok, és feltehetően ennek a kölcsönhatásnak a perturbációja távolról is befolyásolhatja a konformációt.

hibára hajlamos riboszóma kijelzőt alkalmaztak az IgG-Fc mutánsok paneleinek előállításához, amelyeket átvizsgáltak az FcyRIIIa-hoz való fokozott kötődés szempontjából.57 az F243L/T393A/H433P mutánsnak megnövekedett kötési affinitása volt az FcyRIIIa iránt, és kimutatták, hogy ~négyszeresére növelte az ADCC-t. Bizonyítékot mutattak be arra, hogy az F243L mutáció leginkább felelős a fokozott aktivitásért; a jobb funkció azonban szorosabban korrelálhat a glikoformák szintjének megfigyelt növekedésével fukóz hiányzik, de expresszálja az N-acetil-glükózamint. Korábbi vizsgálatok arról számoltak be, hogy a CHO sejtekben előállított F243A mutáns fukozilált volt, és magas szintű galaktozilezett és szialilezett, az FcyRI kötődés jelentős csökkenésével.58

Posted on

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.