cellelinjer og reagenser

både HeLa-og A549-celler blev bestilt fra ATCC og dyrket i Dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM, Gibco 12800-017) indeholdende 10% FBS (Hyclone SN30087.02). IFITM1 -, IFITM2-og IFITM3-antistofferne blev bestilt fra Cellesignalteknologi (13126 S), Proteintech-gruppen (66137-1-IG) og Abgent (AP1153a). Anti-IFITM3 (polyklonal) 10088-604 var fra VVR International. EGFR-antistof var fra Abcam (ab32077). TfR-antistof var fra R & d-systemer (af2474). Aleksa-Fluor 488-CD63 (sc-5275) var fra bioteknologi. Et virus-nukleoproteinantistof (ab20343) var fra Abcam. Aleksa-Fluor 647 Antistofmærkningssæt (A20186) blev bestilt fra Life Technologies. De sekundære antistoffer HRP-konjugeret ged anti-mus IgG (HCL) (115-035-003) og HRP-konjugeret ged anti-kanin IgG (HCL) (111-035-003) blev købt fra Jackson ImmunoResearch. Får IgG peberrod peroksidase-konjugeret antistof (#HAF016) blev bestilt fra Fisher Scientific. Anti-HA antistof konjugeret til Aleksa-Fluor 594 blev købt fra Life Technologies. Anti-HA HRP-konjugeret antistof blev bestilt fra Roche. Ab22595 var fra Abcam. 488 (D22910), dekstran-pHrodo-rød (P10361), transferrin-Aleksa-Fluor 647 (T23366) og rekombinant human EGF (10605hnae25) var fra Life Technologies. Human holo-Transferrin (T0665) var fra Sigma-Aldrich. Human interferon-karrus (IFN-karrus, 8927SC) var fra celle signalering teknologi. 8/34 (H1N1) (10100374) var fra Charles River Laboratories. Magic Red Cathepsin B Assay Kit (937) var fra immunokemi teknologier. Bafilomycin A1 (ab120497) var fra Abcam. 6-TAMRA, speciel formulering (6-carboksytetramethylrhodamin, AS-81122) var fra ANASPEC. Site-Directed Mutagenesis Kit (#200523) var fra Agilent Technologies. T7 endonuklease i (M0302S) var fra Ny England BioLabs.

plasmider

pEF-IFITM1, IFITM2, IFITM3 blev klonet ved PCR-amplifikation og indsat i en pEF6-BSD-vektor. Alle mutanter af IFITM3 blev genereret ved hjælp af multi-Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). PCAS9-plasmidet og gRNA-basisvektoren (pGL3-U6)var gaver fra Peking University 51.

t7e1 assay

celler blev lyseret til genomekstraktion efter transfektion med gRNA og cas9 plasmider i 60-72 timer. gRNA-målstedet blev forstærket ved anvendelse af genom PCR-primere (hIFITM3-GF1: AGGAAACT GTTGAGAAACCGAA; hIFITM3-GR1: GCTAGTGGATAGCCGGGAC). PCR-produkterne blev gelrenset, efterfulgt af denaturering og udglødning. Udglødningsblandingen blev behandlet med T7 endonuklease i i 15 minutter ved 37 liter C, og spaltningseffektiviteten blev derefter overvåget ved gelelektroforese.

generering og karakterisering af IFITM–mutantcellelinjer ved CRISPR-Cas9

gRNA-plasmidet blev konstrueret ved at indsætte gRNA-oligoer i en pGL3-U6-vektor gennem Golden Gate-ligering. Celler blev transfekteret med gRNA, pCas9 og pcDNA6-Puro med et forhold på 1:1:0,1 (larg). Efter 48 timer blev cellerne løsnet og opdelt i to dele. En del blev lyseret til t7e1-analyse for at kontrollere spaltningseffektiviteten af specifikt gRNA; en anden del blev gensået i seks-brøndsplader ved forskellige fortyndinger. Puromycin blev tilsat for at vælge de positive kloner. Efter udvælgelse i en uge blev de adskilte cellekolonier plukket ud i en ny 24-brøndsplade. Nye cellekolonier blev udvidet og analyseret ved vestlig blot og genomsekventering for at evaluere knockout-effektiviteten.

til vestlig blot-analyse blev celler lyseret med natriumdodecylsulfat (SDS) lysis buffer (2% SDS, 50 mM Tris, 2 mM EDTA) og kogt i 10 minutter ved 98 liter C. Til immunudfældning blev celler lyseret med Brij-buffer (0.1 mM triethanolamin (TE), 150 mM NaCl, 1% BrijO10 (pH7.4)) indeholdende EDTA-fri proteasehæmmerblanding, derefter inkuberet med anti-HA affinitetsperler (Sigma). Alle primære antistoffer blev anvendt ved en 1:1.000 fortynding, og sekundært antistof blev anvendt ved 1: 5.000.

til genomisk sekventering af IFITM-kloner blev total genom ekstraheret ved hjælp af et genomekstraktionssæt fra CHIAGEN. Det målgenomiske sted blev forstærket af genspecifikke primere. De forstærkede fragmenter blev tilsat ved 3 ‘ – enden af tak polymerase og derefter ligeret med T-vektorer. Efter transformation blev ti bakteriekolonier plukket tilfældigt og sendt til sekventering.

virusinfektioner

a549, HeLa, Vero (hvem) og Huh-7,5 celler blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS. A549-og HeLa-celler blev anvendt i funktionelle undersøgelser (virusreplikationsanalyser), mens Vero-og Huh-7,5-celler blev anvendt til virusproduktion og virustitrering. Alle cellelinjer blev testet negative for kontaminering med mycoplasma og blev opnået fra ATCC (med undtagelse af Huh-7.5, som var fra Chisari lab (Scripps Research Institute, La Jolla, CA)).

HeLa-eller a549-celler blev inficeret med A/PR/8/34-virus (H1N1) ved en MOI på 2,5 i 12 timer. inficerede celler blev vasket med PBS og høstet under anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA. Cellerne fikseres i 3,7% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter og gennemsyres med 0,1% Triton 100 i 10 minutter. Celler blev farvet med antistof (NP) antistof (1: 333; Abcam, ab 20343) og direkte konjugeret til Aleksa-Fluor 647 ved anvendelse af et 100-Karin-antistofmærkningssæt (Invitrogen). Alle antistoffer blev fortyndet i 0,1% Triton H-100 i PBS, og cellerne blev farvet i 20 minutter. Cellerne blev vasket to gange med 0,1% Triton 100 i PBS efter hver antistofbehandling. PBS blev anvendt til endelig resuspension af celler til cytometrisk analyse ved anvendelse af et FACS Canto II strømningscytometer (BD Biosciences).

HeLa-eller A549-celler blev podet i 24-brøndsplader (5 liter 104 celler/brønd) og inkuberet natten over (16 timer) i nærvær eller fravær af IFN-liter 1 i en koncentration på 100 liter/mL. Derefter blev celler vasket med Opti-MEM (Gibco) før infektion. Vira blev fortyndet i Opti-MEM ved den angivne Moi ‘ er, og celler blev inokuleret i 2 timer ved 37 liter C. Efter inkubation blev viral inokulum fjernet, og kulturer blev vasket tre gange med opti-mem, før DMEM blev tilsat igen. Behandling med IFN-karrus1 blev fortsat gennem forsøgene. Celler inficeret med GFP-mærkede vira blev høstet på angivne tidspunkter for at måle infektion ved strømningscytometri. Genereringen af virale lagre for følgende vira er tidligere beskrevet: YFV-Venus52 (afledt af YF17D-5 ‘ C25venus2aubi), VNV-GFP53 (afledt af pbelo-VNV-GFP-rs ic), DENV-GFP54 (afledt af IC30P-A, en infektiøs klon i fuld længde af stamme 16681), VEEV-GFP55 (afledt af ptc83-GFP infektiøs klon), ONNV-GFP56 (afledt fra infektiøs klon ponnv.GFP) og VSV-GFP (generøst leveret af J. Rose, Yale). PRVABC59 opnået fra CDC, Ft. Collins) blev forstærket i Huh – 7,5 celler og titeret af plakassay på Huh-7,5 celler. Eksperimenter med VNV blev udført i biosikkerhedsniveau 3 (BSL3) indeslutning i overensstemmelse med institutionelle og føderale retningslinjer. Inficerede celler blev høstet i 300 liter-akkumuleringscelledissociationsmedium (eBioscience) og overført til en 96-brøndblok indeholdende 300 liter 4% PFA. Celler blev pelleteret ved 930 r. c. f.i 5 minutter ved 4 kg C, resuspenderet i kolde PBS indeholdende 3% FBS og opbevaret ved 4 kg C indtil FACS-analyse. Blev høstet som beskrevet ovenfor og efterfølgende farvet under anvendelse af et monoklonalt antistof for flavivirusgruppeantigen 4G2 (Millipore) ved 1:500 som et primært antistof og anti-kanin Aleksa-Fluor 594 ved 1: 1.000 som et sekundært antistof. Ud over celler blev supernatanter fra SIKV-infektioner høstet for at bestemme virale titere ved standard plakassay udført på Huh-7,5 celler. Alle prøver blev analyseret ved hjælp af lsrii-strømningscytometeret (BD Biosciences) udstyret med en 488 nm og en 561 nm laser til påvisning af GFP, YFP (Venus) og RFP. Data blev analyseret ved hjælp af Treestar med en kompensationsmatrice på 0,1%.

fluorescensmikroskopi

celler blev dyrket på glasdækslips i seks brøndplader. Efter behandlinger, celler blev vasket med PBS to gange, monteres med 4% PFA for 10 min, permeabilized med 0,2% Triton X-100, – for 10 min, blokerede med 1% bovint serumalbumin (BSA, Roche, 735094) i 1 time, og inkuberet med primært antistof fra kanin anti-IFITM3 (1:100 fortyndet i 1% BSA; Proteintech gruppe, 11714-1-AP) efter 1,5 timer, efterfulgt af sekundært antistof anti-kanin-Alexa Fluor 647 sammenhængende bladpar (1:1,000; Abcam, ab150083) i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev dækslipene monteret på dias ved hjælp af monteringsmedium indeholdende DAPI, og cellerne blev undersøgt ved inverteret LSM 780-laserscanningskonfokalt mikroskop.

eksogene lastoptagelsesanalyser

celler blev serumsultet i 45 minutter ved 37 liter C i dmem og derefter inkuberet på is i 5 minutter, hvilket blev efterfulgt af tilsætning af 50 liter/ml Aleksa-Fluor 647-konjugeret transferrin (Invitrogen) i DMEM. Efter 30 minutter på IS blev cellerne overført til 37 liter C i 7 minutter eller 20 minutter, pelleteret, vasket i iskold PBS, syrevasket (0.1 M glycin og 150 mM NaCl ved pH 3) to gange, vasket med PBS en gang og fikseret (vægt/vol 3% PFA og 4% saccharose i PBS) før strømningscytometrisk analyse som beskrevet ovenfor.

analyse af dftat optagelse og reduktion

syntese af dftat (dimerisk fluorescerende tat) af Y.-C. Vang var som tidligere beskrevet39. Efter forbehandling med eller uden 100 liter/ml IFN-liter i 16 timer blev cellerne inkuberet med 2 liter dfTAT i DMEM i det angivne tidspunkt, anbragt på is og vasket af iskold PBS tre gange og fikseret (vægt/vol 3% PFA og 4% saccharose i PBS) før strømningscytometrisk analyse eller fluorescensmikroskopi.

analyse af EGFR-og TFR-omsætning

celler blev dyrket til 80% konfluens, vasket to gange med PBS og sultet i serumfri DMEM i 2 timer ved 37 liter C for at maksimere overfladen EGFR og derefter forbehandlet med 10-25 liter/ml cycloheksid i 1 time i serumfri DMEM, hvilket forhindrede syntese af ny EGFR under stimulering af EGF. Umiddelbart efter blev cellerne kontinuerligt stimuleret med 100 ng/ml EGF i 15, 30, 60 eller 120 minutter i nærvær af cycloheksid. Niveauerne af EGFR og tubulin blev bestemt ved vestlig blotting. Til celleoverfladefarvningsforsøg blev celler inkuberet med primært anti-EGFR-antistof (Abcam, ab32077) på is i 40 minutter og vasket tre gange med PBS. 647-konjugerede sekundære antistoffer (Abcam, ab150083) blev derefter inkuberet med cellerne i 40 minutter på is og vasket tre gange med PBS. Celler blev suspenderet i 2% FBS i PBS og straks analyseret via strømningscytometri.

til TFR-omsætningseksperimenter blev celler dyrket til 80% sammenløb, vasket to gange med PBS og sultet i serumfri DMEM i 2 timer ved 37 liter C, derefter forbehandlet med 10-25 liter/ml cycloheksid i 1 time i serumfri DMEM, hvilket forhindrede syntese af ny TfR. Umiddelbart efter blev cellerne kontinuerligt stimuleret med 20 liter / ml Tf i 0, 30, 60, 120 eller 180 minutter i nærvær af cycloheksid. Niveauerne af TFR, IFITM3 og tubulin blev bestemt ved vestlig blotting.

sen endosomfusions-og lysosomfusions-assay

celler blev inkuberet i 4 timer i dyrkningsmedium, der indeholdt 25 purpurrødt dekstran, efterfulgt af en 20 timers jagt i fluoroforfrit medium for at fremme lysosomal akkumulering af dekstran. Cellerne blev derefter inkuberet i medium indeholdende 50 g / ml 488 i 10 min ved 37 g C før udskiftning med fluoroforfrit medium. På de bemærkede tidspunkter blev celler fikseret med iskold 4% PFA til immunofluorescensfarvning.

lysosomale protease-aktivitetsanalyser

Cathepsin B-aktivitet blev analyseret ved hjælp af cathepsin B-aktivitetssættet efter den protokol, der blev leveret af producenten. Efter behandling med IFN-kur i 16 timer med eller uden bafilomycin A1 blev cellerne inkuberet med Magic Red (1:26) i 30-60 minutter ved 37 kur C, før de blev vasket to gange med PBS. Celler blev derefter fikseret ved anvendelse af 4% PFA og analyseret ved strømningscytometri.

aktivitetsbaseret mærkning af cathepsiner (Vergent Bioscience, Pan Cathepsin probe) blev udført som tidligere rapporteret med mindre modifikationer57. Kort sagt blev celler podet 24 timer før mærkning, og celler blev aktiveret med IFN-Luth 16 timer før mærkning. Medier blev udskiftet, og celler blev behandlet med 1 liter iabp Pan Cathepsin-Probe i 2 timer. celler blev vasket med PBS og lyseret på is med en hypotonisk lysisbuffer (50 mM rør pH 7,4, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 4 mM DTT, 1% NP-40). Celleaffald blev fjernet ved at spinde lysater ved 500 liter g i 5 minutter ved 4 liter C. supernatanter blev derefter blandet med 4 gange prøvebelastningsbuffer, og 70 liter total protein blev analyseret af SDS–PAGE. Gelen blev vasket to gange med deioniseret vand før fluorescensanalyse i gel på et Bio-Rad ChemiDoc MP-billeddannelsessystem og coomassie-farvning eller overførsel til vestlig blot-analyse.

DiD-mærkning af vira

oprenset virus A/PR/8/34 (H1N1) og rekombinant VSV,der udtrykker LASV GPC (genereret som tidligere beskrevet41) blev mærket med selvslukkende koncentrationer af det lipofile farvestof 1,1′-dioctactadecyl-3,3,3′, 3′-tetramethylindodicarbocyanin (DiD, Life Technologies). Oprenset virus (1 mg/ml) i PBS blev inkuberet med 50 liter DiD, mens den blev omrørt i 1 time ved 4 liter C. Virus blev adskilt fra overskydende farvestof ved ultracentrifugering gennem en 10% saccharosepude i 2 timer ved 107.000 liter g og 4 liter C ved hjælp af en S41 rotor (Beckman Coulter). Mærkede viruspellets blev resuspenderet i PBS ved en viral proteinkoncentration på 1 mg/ml, aciteret og opbevaret ved -80 liter C indtil brug.

stedsspecifik mærkning af IFITM3 i pattedyrceller

til billeddannelsesundersøgelser med levende celler blev HeLa-celler podet på 35 mm glasbundskåle for at være på ca.70% sammenflydelse til billeddannelse den næste dag. Efter adhærens blev celler transficeret med plasmidet af interesse indeholdende en ha-IFITM3-TAG-variant (1 liter pr.skål) og mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA-plasmidet (1 liter pr. skål) under anvendelse af 3 liter Viafect (Promega) i komplette cellevækstmedier indeholdende unaturlige aminosyrer (TCOK). Efter inkubation natten over blev cellemedier ændret til friske cellevækstmedier uden TCOK. Efter yderligere 2 timers kultur ved 37 liter C/5% CO2 blev celler mærket med tetrasinfluorophorer (250 nM) i FluoroBrite DMEM (Life Technologies) i 30 minutter ved 37 liter C og vasket med komplet cellevækstmedie tre gange over 1 time.

levende cellebilleddannelse

ved epifluorescensmikroskopi med vidvinkel blev celler transduceret med Celllysvektorer (Livsteknologier) for tidlige endosomer (RFP-Rab5), sene endosomer (RFP-Rab7) eller lysosomer (RFP-LAMP1) ca.18 timer før billeddannelse i henhold til producentens anvisninger. Levende cellemikroskopi blev udført som tidligere beskrevet med en Aksioobserver.C1 bredfelt epifluorescensmikroskop udstyret med et 40-liters/ 1,3-na-mål, DAPI/GFP/CY5-filtersæt og opvarmet miljøindkapsling opretholdt ved 37-liters C. HeLa celle monolag blev podet på fibronectin-coatede 35 mm glas coverslip retter (MatTek) 24 timer før forsøg. Celler blev kølet på is i flere minutter før spinokulation af DiD-mærket virus på monolag ved 1.500 liter g og 6 liter C i 20 minutter. Ubundne partikler blev fjernet ved fem vaske med kolde PBS, og 500-kold billeddannelsesbuffer (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM saccharose, 2-liter Hoechst 33342 og 2% FBS) blev tilsat for at dække cellerne. Skålen blev straks monteret på mikroskopets mål og fokuseret. Dækglasskålen blev derefter oversvømmet med 1.5 ml varm billedbuffer til markering af forsøgets start (t = 0). Billeder blev erhvervet hvert 10.sekund i løbet af eksperimenterne ved hjælp af et enkelt å-afsnit, som omfattede næsten alle celleassocierede partikler.

til konfokal mikroskopi blev HeLa-celler podet i 35 mm glasskåle (ibidi) og dyrket natten over. Den næste dag blev celler transficeret med plasmidet af interesse indeholdende en ha-IFITM3-TAG-variant (1 liter pr.skål) og mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA-plasmidet (1 liter pr. skål) under anvendelse af 6 liter Lipofectamin 3000 i komplette cellevækstmedier indeholdende TCOK. Efter 16 h inkubation blev cellemedier ændret til friske cellevækstmedier uden TCOK. Efter yderligere 6 timers kultur ved 37 liter C/5% CO2 blev celler mærket med tetrasin-BODIPY (500 nM) i FluoroBrite DMEM (Life Technologies)/10% FBS for 0,5 timer ved 37 liter C og vasket med FluoroBrite DMEM (Life Technologies)/10% FBS fire gange over 2 timer. endelig blev celler farvet med Nucblue levende cellefarve (Life Technologies) i 20 minutter og afbildet i FluoroBrite DMEM / 10% FBS med konfokal mikroskopi. Til plasmamembranfarvning blev celler farvet med CellMask Rød (1:1.000, Livsteknologier) i levende Celleafbildningsopløsning (LCIS) i 5 minutter ved 37 liter C og vaskes med LCIS tre gange før farvning med Nucblue levende cellefarve. Celler blev afbildet på et inverteret LSM 780-laserscanningskonfokalt mikroskop (Seiss) med et Tidsvis Plan-Apokromatisk 63 liter/1.4 N. A. olie nedsænkningsmål. Mikroskopet var udstyret med en fase-top inkubator indstillet til 37 liter C/5% CO2 til levende celleafbildning. Hoechst var begejstret med en 405 nm laser med emissionsspektre opsamlet mellem 410 nm og 480 nm. BODIPY var begejstret med en 488 nm laser med emissionsspektre opsamlet mellem 490 nm og 550 nm. CellMask Red var begejstret med en 561 nm laser med emissionsspektre opsamlet mellem 570 nm og 620 nm. Billeder blev erhvervet med programmet 2012 og analyseret af ImageJ (NIH). Pearsons korrelationskoefficienter blev beregnet i ImageJ ved hjælp af Coloc 2 plugin.

dataanalyse

billedanalyse og enkeltpartikelsporing blev udført ved hjælp af Volocity-programmer (PerkinElmer) som tidligere beskrevet41. Billedfiler blev ikke manipuleret, bortset fra mindre justeringer i lysstyrke og kontrast. Viral puncta blev tærsket af indledende intensitet og størrelse. Puncta, der falder uden for området 0,25 til 1 liter 2 forventet af individuelle DiD-mærkede virioner, blev udelukket fra enkeltpartikelanalyse. Virioner blev kun betragtet som kolokaliseret med LAMP1 eller IFITM3, hvis den cellulære markør punctum overskred baggrundssignalet med 30% eller mere, og hvis GFP eller BODIPY og gjorde puncta Co-trafficked med større end 70% overlapning af signaler. Gennemsnitsmålinger (kr. s. D.) blev afledt af tre separate eksperimenter, medmindre andet er angivet.

analyse af Ha-IFITM3-TCOK ekspressionsniveauer

til vestlig blot-analyse blev HeLa-celler podet i seks-brøndsplader og dyrket natten over. IFITM2/3-KO-celler blev transficeret med HA-IFITM3-f8tag (2,5 liter) og Mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA (2,5 liter) i nærvær af TCOK (50 liter) i 16 timer. Hela VÆGTCELLER blev efterladt ubehandlet eller behandlet med IFN-liter (100 ng/ml) i 16 timer. niveauerne af IFITM3 blev bestemt ved vestlig blotting ved anvendelse af kaninanti-IFITM3 (1:1, 000; Proteintech group, 11714-1-AP) og sekundært antistof HRP-konjugeret Gede Anti-kanin IgG (HCL; 111-035-003).

til immunofluorescensanalyse blev IFITM2/3-KO-celler transfekteret med HA-IFITM3-F8TAG (1 liter) og Mm-PylRS-af/Pyl-tRNACUA (1 liter) i nærvær af TCOK (50 liter) i 16 timer. Hela vægt-celler blev ubehandlet eller behandlet med IFN-liter (100 ng/ml) i 16 timer. celler blev derefter fikseret med formaldehyd, permeabiliseret med saponin (0, 5%) og immuniseret med kanin anti-ifitm3 (1:100) (proteintech gruppe, 11714-1-AP) og anti-kanin-Aleksa fluor 647 konjugat (1:1.000) (Abcam, ab150083) til konfokal fluorescensafbildning. Hoescht (blå) bruges til at plette kerner. Celler blev afbildet på et inverteret LSM 780-laserscanningskonfokalt mikroskop (Seiss) med et plan-Apokromatisk 63 liter/1.4-oliedypningsmål. Billeder blev taget under identiske konfokale mikroskopindstillinger.

til strømningscytometryanalyse blev IFITM2/3 KO-celler transficeret med HA-IFITM3-F8TAG (1 liter), Mm-PylRS-af//Pyl-tRNACUA (1 liter) i nærvær af TCOK (50 liter) i 16 timer. Celler blev vasket to gange med PBS og derefter fikseret med 400 liter PBS med 4% PFA i 10 minutter. De faste celler blev permeabiliseret med 200 liter 0,2% saponin i PBS i 10 minutter og derefter blokeret med 200 liter 0,2% BSA og 0,2% saponin i PBS i 10 minutter. Celler blev behandlet med kanin anti-IFITM3 (1:300) (Proteintech gruppe, 11714-1-AP) og anti-kanin-Aleksa Fluor 647 (1: 1.000) (Abcam, ab150083) i PBS med 0,02% saponin. Efter tre vaske med PBS blev cellerne resuspenderet i 150 PBS med 0,2% BSA og 0,02% saponin. Prøverne blev analyseret ved strømningscytometri (BD LSRII). Dataanalyse blev udført ved hjælp af .

IAV-infektion med IFITM3 Cys-mutanter

IFITM2/3 KO HeLa-celler blev podet i 12 brøndplader (Corning) og dyrket natten over. Celler blev co-transfekteret med HA-hIFITM3-konstruktioner (1 liter/brønd) og mm-PylRS-af/Pyl-tRNA-plasmidet (1 liter/brønd) under anvendelse af 3 liter Lipofectamin 3000 i 1 ml komplet cellevækstmedie indeholdende 10 liter 100 mM BocK (endelig koncentration 1 mM). Efter 16 timer blev celler inficeret med virus A/PR/8/34 virus (H1N1) med MOI på 5. Efter 6 timers infektion blev cellerne trypsiniseret og opsamlet i klyngerør (Corning). Celler blev vasket to gange med PBS og derefter fikseret med 400 liter PBS med 4% PFA i 10 minutter. De faste celler blev permeabiliseret med 200 liter 0,2% saponin i PBS i 10 minutter og derefter blokeret med 200 liter 0,2% BSA og 0,2% saponin i PBS i 10 minutter. Celler blev behandlet med NP-antistof konjugeret med aleksafluor-647 og anti-HA-antistof konjugeret med Aleksafluor-594 (1:250) i PBS med 0,02% saponin. Efter tre vaske med PBS blev cellerne resuspenderet i 150 PBS med 0,2% BSA og 0.02% saponin. Prøverne blev analyseret ved strømningscytometri (BD LSRII). Alle prøver blev først gated ved HA-positiv farvning, hvilket indikerer vellykket transfektion og derefter NP-positiv procentdel af NP-positiv farvning, hvilket indikerer vellykket infektion. HA-tag-epitopen er afledt af en H3-virusstamme og er ikke til stede i PR8-stammen af H1N1-virus. Dataanalyse blev udført ved hjælp af .

s-palmitoyleringsassays

metabolisk mærkning af celler med alkyne-palmitinsyre reporter alk-16 blev udført som tidligere beskrevet58 med nogle modifikationer. Alk – 16 og ase-rho blev syntetiseret som tidligere rapporteret58. IFITM2 / 3 KO HeLa-celler blev transficeret med HA-hIFITM3-konstruktioner som beskrevet ovenfor. Efter 16 timer blev celler inkuberet med 50 liter alk-16 i DMEM indeholdende 10% FBS i 2 timer. celler blev høstet, vasket en gang med PBS og lyseret i 1% Brij 97 (Sigma) i 50 mM TE, 150 mM NaCl pH 7,4, 1 gang Roche proteasehæmmer og 1.500 enheder/ml BENSONASE (EMD). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA-analysen. For immunoprecipitation, 150 µg af den samlede protein blev tilføjet til 20 µl af anti-HA-antistof konjugeret agarose (Sigma) i et samlet volumen på 150 µl, og rystet ved 4 °C i 1 time. Agarose-perler, der blev vasket af resuspension i 500 µl 50 mM HEPES-buffer (indeholdende 150 mM NaCl, pH 7.4) ved centrifugering på $ 3.500 × g til 30 s. Perlerne var så resuspenderet i 45 µl af den ovenfor buffer og 5 µl af CuAAC reaktant-løsning (0.5 µl 10 mM azido-rhodamine (endelig koncentration på 100 µM), 1 µl 50 mM frisklavet CuSO4·5H2O i H2O (endelig koncentration på 1 mM, Sigma), 1 µl 50 mM frisklavet TCEP (endelig koncentration på 1 mM) og 2,5 ĩl af 10 mM Trisamine (TBTA) (endelige koncentration 500 µM) blev tilføjet. Prøverne blev rystet ved stuetemperatur i 1 time og vasket to gange med RIPA-buffer. Laemmli – prøvebuffer (20 liter) blev sat til prøverne (1,0:1,3 forholdet mellem buffer og prøve), som blev opvarmet i 10 minutter ved 95 liter C og adskilt ved gelelektroforese. Fluorescensscanning i gel blev udført under anvendelse af et Bio-Rad CHEMIDOC MP-billeddannelsessystem. Vestlige blots for HA-mærkede proteiner blev udført under anvendelse af et anti-HA HRP-konjugeret antistof (1: 1.000; Roche). Kvantificering af båndintensiteter i fluorescensgeler og vestlige blots blev udført med Image Lab (Bio-Rad). Data fra tre biologiske replikater blev kvantificeret og gennemsnitligt til plotning.

Rapporteringsoversigt

yderligere information om forskningsdesign findes i Nature Research Reporting Resume, der er knyttet til denne artikel.

Posted on

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.